一種海洋擬諾卡氏菌產生的胞內中性β-葡萄糖苷酶

吳少杰 , 馬桂珍 王淑軍 陳 麗 , 王淑芳

(1. 淮海工學院 海洋學院, 江蘇 連云港 222005; 2. 江蘇省海洋生物技術重點實驗室 淮海工學院, 江蘇 連云港 222005; 3. 江蘇海洋資源開發研究院, 江蘇 連云港 222001)

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是一類能夠水解結合于末端的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵, 同時釋放出β-D-葡萄糖和相應配基的酶。

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中, 它可以來源于植物、微生物, 也可來源于動物, 有著多種生理活性和應用前景。β-葡萄糖苷酶參與生物體的糖代謝, 對維持生物體正常生理功能起著重要作用。哺乳動物和人類溶酶體內β-葡糖苷酶的缺陷, 將使葡糖腦苷脂貯積在各器官的單核巨噬細胞中, 累及骨髓、肝脾、骨骼及神經系統, 形成“戈謝氏病”, 而應用基因重組β-葡糖苷酶治療此病已獲得成功[1]。在藥物研究與開發上, 由于大多數中草藥活性成分都含有β-葡萄糖苷基, 因此,β-葡萄糖苷酶廣泛地用于天然藥物的生物轉化與合成[2-3]。β-葡萄糖苷酶也是纖維素降解酶系的重要組成部分, 但在微生物中分泌量少、活力低, 是纖維素酶解的限速酶、成為纖維素酶解的瓶頸環節; 通過人工添加外源β-葡萄糖苷酶有助于提高纖維素的水解效率[4]。此外,β-葡萄糖苷酶能將果、蔬、茶等主、副食品中的風味前體物質水解為具有濃郁天然風味的香氣物質, 因而被稱為“食品風味酶”[5]。目前, 我國尚未具備大規模生產β-葡萄糖苷酶的條件; 對各種來源的β-葡萄糖苷酶開展研究, 具有重要的經濟和應用價值。

據報道, 幾乎所有的β-葡萄糖苷酶都是酸性酶類, 其最適反應pH一般低于7.0(大多數在pH 3.5～5.5)[6], 這必然會限制這種酶在某些方面的應用。目前, 中性或堿性β-葡萄糖苷酶僅有個別報 道[7-8], 且大都是來自于芽孢桿菌類。本文報道一株海洋放線菌株HY-G及其所產生的中性胞內β-葡萄糖苷酶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海洋擬諾卡氏菌(Nocardiopsissp.)菌株HY-G, 由本實驗室分離自海洋環境, 目前保存在中國典型培養物保藏中心(保藏號: CCTCC M 2010126)。p-NPG: SIGMA公司; 蛋白質標樣: 江蘇碧云天生物技術有限公司; 硅膠薄層層析板: 安徽皖西硅源材料廠; 各種凝膠色譜填料均來自Pharmacia公司; 其他藥品均為分析純。

1.2 儀器與設備

CR22G高速冷凍離心機: 日本日立; SPX-250B生化培養箱: 上海躍進醫療器械廠; HZQ-F160全溫振蕩培養箱: 舟山市定海區海源儀器廠; BANDELIN HD2200型超聲波細胞破碎儀: 寧波新芝生物科技股份有限公司; 680型酶標儀: Bio-rad公司。BioLogic DuoFlow快速蛋白純化系統: Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產酶培養條件與胞內酶的提取

產酶培養條件與胞內酶的提取見文獻 [3]。

1.3.2 酶活力測定

以p-NPG為底物, 酶液和5 mmol/L的p-NPG溶液各50 μL, 置40℃水浴保溫10 min后, 加入1 mol/L NaOH 100 μL終止反應, 立即用酶標儀測定A400。酶活力定義為: 每分鐘催化生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

1.3.3 酶的分離純化

1.3.3.1 硫酸銨分部鹽析

4℃條件下, 加入硫酸銨粉末, 分別至飽和度40%、60%、80%和100%, 靜置1 h后12 000 r/min離心20 min, 分別收集沉淀, 用pH 6.8的磷酸緩沖液溶解沉淀, 4℃下透析24 h后, 按1.3. 2的方法測定不同飽和度下的A400以確定最佳鹽析飽和度。

1.3.3.2 Phenyl-Sepharose疏水層析

用1.7 mol/L的硫酸銨溶液平衡Phenyl-Sepharose疏水層析柱; 將經過40%飽和度鹽析并除去沉淀后的粗酶液直接上柱分離。用快速蛋白純化系統進行梯度洗脫, 其中A泵為1.7 mol/L的硫酸銨溶液, B泵為0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.8), 流動相流速1 mL/s。洗脫方式為: 1.7 mol/L的硫酸銨溶液40 mL、梯度(A泵0%～100%)洗脫70 mL, 磷酸緩沖液(10 mmol/L, pH6.8)75mL, 最后用1.7 mol/L的硫酸銨溶液重新平衡層析柱。收集A280下的各峰并檢測酶活性。

1.3.3.3 DEAE-Sepharose離子交換層析

用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 6.8)平衡柱子后, 將Phenyl-Sepharose疏水層析柱上收集的活性組分上樣。用快速蛋白純化系統進行梯度洗脫, 其中A泵為10 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8), B泵為1 mol/L NaCl溶液, 流動相流速1 mL/s。洗脫方法為: 50 mL 10 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)、梯度(A泵0%～100%)130 mL、1 mol/L NaCl溶液20 mL, 最后用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.8)重新平衡層析柱。收集A280下的各峰并檢測酶活性。

1.3.3.4 Superdex 200 HR 10/300 mm凝膠色譜

用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)平衡柱子。將DEAE-Sepharose陰離子交換層析的活性組分經透析后, 上樣, 用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)洗脫, 收集A280下的各峰并檢測酶活性。用標準蛋白質(含甲狀腺球蛋白, MW 669.0 kD、鐵蛋白, MW 440.0 kD、牛血清白蛋白, MW 67.0 kD、β-乳球蛋白, MW 35.0 kD、核糖核苷酸酶A, MW 13.7 kD、細胞色素C, MW 13.6 kD、抑肽酶, MW 6.5 kD)作為標準蛋白, 在同樣條件下洗脫, 以估計β-葡萄糖苷酶的分子質量。

1.3.3.5 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

分離膠(水1.6 mL, 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.3 mL, 10% SDS溶液0.05 mL, 30%丙烯酰胺2 mL, TEMED 0.002 mL, 10%APS 0.05 mL)、濃縮膠(水3.4 mL pH6.8 0.5 mol/L Tris-HCl 0.63 mL, 10%SDS 0.05 mol/L, 30%丙烯酰胺0.83 mL, TEMED 0.005mL, 10%APS 0.05mL)。在Tris-甘氨酸電泳緩沖液中, 80～100V電泳一定時間。電泳結束后, 用考馬斯亮藍染液染色。

1.3.4 菌株的分子鑒定

用上海賽百盛?細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌基因組DNA, -20℃保存備用。PCR引物為通用引物, 序列為: F27 (5’-AGAGTTTGATCCTGGCT- CAG-3’)、R1492 (5’- TACGGCTACCTTGTTACGA- CTT-3’)。PCR反應體系(50 μL): Tag酶(大連寶生物)0.25 μL; Buffer(不含Mg2+) 5 μL; Mg2+溶液3 μL; dNTP 4 μL; 模板DNA 1 μL; 引物F27和引物R1492各1 μL。PCR反應條件: 94℃預變性2 min, 然后94℃變性30 s、55℃退火45 s、72℃延伸45 s(循環33次), 最后72℃延伸7 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離, 然后用江蘇碧云天生物技術有限公司的DNA凝膠回收試劑盒純化回收。將純化后的PCR產物送到上海生工生物工程有限公司測序。使用DNAMAN 6.0軟件并采用最大似然法構建菌株的系統進化樹, 進化樹經過1000次自舉分析。

2 實驗結果

2.1 硫酸銨分級鹽析與鹽析沉淀的β-葡萄糖苷酶活力測定

通過不同飽和度的硫酸銨分級鹽析后離心得到沉淀; 沉淀經透析后用pH7.0的硫酸緩沖液稀釋成相同體積, 然后測定酶活力(以A400計), 得到的結果如表1所示。

由表中可見, 在40%的硫酸銨飽和度下, 沉淀沒有酶活力, 說明酶蛋白保留在溶液中, 沒有被沉淀下來; 而到了60%的飽和度, 酶蛋白開始沉淀出來; 到了80%的飽和度, 大部分酶蛋白都已經沉淀。考慮到下一步將采用疏水柱進行純化, 故將硫酸銨鹽析的飽和度選為40%(相當于硫酸銨濃度1.7 mol/L)。在該飽和度下, 離心去除沉淀后, 上清液可直接用疏水柱分離。

表1 不同硫酸銨飽和度下沉淀的酶活力(A400) Tab. 1 Enzyme activity of deposits with different saturation of ammonium sulfate(A400)

2.2 酶的層析分離純化與分子量估算

經過硫酸銨鹽析和疏水、離子交換及分子篩層析分離, 將各個步驟下獲得的酶蛋白分別電泳, 電泳圖譜如圖1(左)所示。可見, 經過硫酸銨鹽析和各種柱層析分離, 最終獲得了凝膠電泳單一條帶的β-葡萄糖苷酶。通過與蛋白Marker比較計算, 得出其估計分子質量為43.3 kD。

圖1 各純化步驟對酶的純化效果(左)及酶蛋白分子質量估測(右) Fig. 1 The purity of β-glucosidase at different steps (left) and its molecular weight (right)

在進行凝膠柱層析分離的同時, 也能進行蛋白質分子質量的估算。在進行Superdex 200 HR 10/300凝膠柱分離時, 得出β-葡萄糖苷酶活性峰的洗脫體積為15.1 mL。通過與標準蛋白質的洗脫體積相比較, 得出如表2中所示的洗脫體積與蛋白質分子質量(MW)的對應關系。上述數值采用Origin 7.0進行線性擬合分析, 得出了蛋白質分子質量的對數“lg(MW)”與洗脫體積“V”的線性擬合方程為: lg (MW) = 5.29067 - 0.23231V(R2= 0.98780)。根據此方程, 計算出海洋放線菌株HY-G產生的β-葡萄糖苷酶分子量為45.0 kD。上述估計值和通過SDS凝膠電泳估計的分子量(43.3 kD)相近。

通過上述兩種方法得到的分子質量結果相似, 表明海洋放線菌株HY-G產生的β-葡萄糖苷酶為單聚體, 不含亞基, 其分子質量為43.3～45.0 kD。

2.3 酶性質研究

2.3.1 最適pH和最適溫度

稱取一定量凍干的酶, 分別用pH 4.0～11.0的各種緩沖液溶解, 分別測定酶活力, 結果如圖2所示。海洋放線菌株HY-G產生的β-葡萄糖苷酶在以p-NPG為底物時, 最適pH都為pH 7.0～8.0。據報道, 幾乎所有的β-葡萄糖苷酶都屬于酸性酶類, 其最適反應pH值一般低于7.0(大多數在pH 3.5～5.5), 因而限制了其在某些方面的應用。中性或堿性β-葡萄糖苷酶迄今僅有個別報道, 且都是來自于芽孢桿菌類。而從海洋擬諾卡氏菌株HY-G中分離到的β-葡萄糖苷酶, 最適作用pH偏堿性, 因此可能是一種新型的β-葡萄糖苷酶。取pH 7.0的酶液, 分別在20～70℃下測定酶活力。可見, 其最適溫度為40℃, 同時, 在30～50℃范圍內, 酶活力變化不大(圖2)。

2.3.2 pH穩定性和溫度穩定性

為了測定酶的pH穩定性, 將不同pH值(pH 4.0～11.0)的酶液在4℃冰箱中保存24 h后, 調整到pH7.0, 然后分別測定殘余酶活力。為了測定酶的溫度穩定性, 取pH 7.0的酶液, 分別在30～80℃下保溫30 min后, 測定殘余酶活力。結果如下圖所示。可見, 該酶在pH 6.0～7.0時最穩定, pH＜5或pH ＞8時, 酶活力迅速下降; 在70℃下30 min仍能保存56%的酶活力, 說明該酶具有較好的耐熱性。

表2 蛋白質分子量與Superdex 200凝膠柱洗脫體積的關系及β-葡萄糖苷酶的分子量估算值 Tab. 2 The relationship between MW and elution volume, and the estimated MW of the β-glucosidase

圖2 酶催化的最適pH和最適溫度(▲ 最適pH; ■ 最適溫度) Fig. 2 The optimal pH and temperature of the β-glucosidase (▲ optimal pH; ■ optimal temperature)

圖3 酶的pH和溫度穩定性(▲pH 穩定性; ■溫度穩定性) Fig. 3 The pH and temperature stability of the β-glucosidase (▲ pH stability; ■ temperature stability)

2.3.3 金屬離子對酶活力的影響

采用含有濃度為10 mmol/L不同金屬離子的緩沖液(pH 7.0), 然后按照3.1.2的方法測定酶活力。以不添加金屬離子的酶反應體系為空白對照(相對酶活力為100%), 確定各金屬離子對酶活性的抑制或激活作用, 結果見表3。

表3 金屬離子對酶活力的影響(n = 3) Tab. 3 The effects of ions on the activity of the β-glucosidase

由表中可見, Fe2+、Mg2+、Pb2+、Na+、Fe3+對該酶活性有促進作用, 其中Fe2+、Fe3+促進作用較大; Ca2+、Zn2+、Ag+、Cu2+、K+對該酶活性有抑制作用, 其中Zn2+、Ag+、Cu2+抑制作用較大。

2.4 菌株鑒定

經過PCR擴增, 得到了海洋擬諾卡氏菌株HY-G近全長16 S rRNA基因片段。通過測序, 得出了其核酸序列。上述核酸序列與GenBank上的序列進行比對分析, 發現該菌株HY-G與Norcardiopsis菌屬的許多菌株序列相似度都在98%以上, 其中與塘沽擬諾卡氏菌(Norcardiopsis tangguensis)和埃及擬諾卡氏菌(Norcardiopsis aegyptia)的序列相似度都為99.9%(1393/1395)。通過構建系統進化樹進行進一步分析(圖4), 可以看出, 菌株HY-G也與菌株Norcardiopsis tangguensis、Norcardiopsis aegyptia也聚成了一簇, 支持度為100%, 表明與這兩株菌的親緣關系較近。

3 討論

β-葡萄糖苷酶廣泛存在于自然界中。目前已報道的β-葡萄糖苷酶中, 中性或堿性酶非常罕見, 下表列出了目前報道的幾種不同來源的中性或堿性β-葡萄糖苷酶。可以看出, 這幾種中性或堿性β-葡萄糖苷酶都是來自于細菌且多數都是來自芽孢桿菌, 如嗜熱采油芽孢桿菌(Geobacillus thermodenitrificans)、環狀芽胞桿菌嗜堿性亞種(Bacillus circulanssubsp.alkalophilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等, 目前, 放線菌未見產生中性或堿性β-葡萄糖苷酶的報道。在擬諾卡氏菌中, 有關于擬諾卡氏菌產生 耐熱型α-淀粉酶[11]、堿性蛋白酶[12]和絲氨酸內肽酶[13]等報道, 但未見該屬微生物產生β-葡萄糖苷酶的報道。該菌株產生的β-葡萄糖苷酶, 分子質量與其他中性或堿性β-葡萄糖苷酶相近, 最適溫度也相差不大, 但與芽孢桿菌所不同的是, 海洋擬諾卡氏菌株HY-G中的β-葡萄糖苷酶是屬于胞內酶。

圖4 海洋放線菌菌株HY-G的系統進化分析 Fig. 4 Phylogenetic tree showing the relationships among strain HY-G and Nocardiopsis species.

表4 目前報道的幾種中性或堿性β-葡萄糖苷酶 Tab. 4 Features of some reported neutral or alkaline β-glucosidase

擬諾卡氏菌是一種比較稀有的放線菌, 目前已經鑒定的有30余種(NCBI - taxonomy, 2012)。海洋擬諾卡氏菌株HY-G分離自河北樂亭海灘, 由于其地理位置與天津塘沽很近, 并且它們的16S rRNA基因也高度相似, 因此該菌株與塘沽擬諾卡氏菌的關系尚需進一步確認。

海洋高鹽堿性這一特殊環境, 可能造成海洋微生物能產生不常見的中性或堿性糖苷酶, 例如堿性淀粉酶[14]、堿性纖維素酶[15]等; 海洋擬諾卡氏菌株HY-G能產生堿性β-葡萄糖苷酶, 可能也與其所生存的海洋環境有關。由于大多數普通β-葡萄糖苷酶在pH＞7時活力較低, 而中性或堿性β-葡萄糖苷酶在這種情況下具有最佳的水解活力, 因此能夠拓展β-葡萄糖苷酶的應用場合。海洋擬諾卡氏菌株HY-G具有營養需求簡單、培養條件溫和、容易形成菌絲體顆粒而便于收獲胞內酶等特點; 其產生的β-葡萄糖苷酶是一種中性酶, 不僅酶活力較高, 而且酶分子質量較小, 便于采用基因工程手段進行克隆和高效表達。因此, 該菌株及其所產的酶具有良好的開發應用前景。

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