應用黃金分割法優選小球藻的培養溫度

劉志媛, 周俊如, 崔玉兵, 鄭陣兵, 王 珺

(海南大學 海洋學院, 海南 海口570228)

微藻是一類個體微小的單細胞或多細胞植物, 能夠有效地利用太陽能, 通過光合作用將無機物轉化為脂類、蛋白質、多糖及色素等高附加值的代謝產物。微藻用途廣泛, 不僅是魚、蝦、貝類幼體或成體的直接或間接的活餌料, 還是藥品和保健品的原料[1]。此外, 含油量高的微藻被認為是生物柴油的理想生物原料[2-4]。

海南光熱充足, 微藻資源豐富, 具有開發微藻產業的巨大優勢。篩選微藻資源, 研究其生物學性狀, 優化其培養條件, 是微藻資源開發和利用的必要前提。溫度是影響微藻生長和代謝產物積累的關鍵環境因子之一, 因而溫度培養條件最佳點的選擇是微藻資源評價以及微藻生物質生產高產和優質的關鍵。然而微藻最適溫度培養條件選擇是一項極其繁瑣和耗時的工作, 需要在溫度控制儀器中進行多次實驗獲得, 且實驗次數的增加必然會增加實驗誤差, 降低實驗結果的準確性。為減少實驗次數, 縮短實驗周期, 本研究以兩株分離自?？诮逗Ｓ虻男∏蛟?Chlorellaspp.)為材料, 采用黃金分割優選法對其最適生長溫度進行優化, 以期提高微藻培養溫度優化實驗的效率。

黃金分割法優選法又稱0.618優選法, 是一種較簡單的優選方法, 首先由數學家華羅庚等在20世紀70年代初在釀酒等生產單位開始推廣并大量應用。其基本思想是: 以區間的0.618處作為探測點, 通過取探測點和探測點上函數值的比較, 使包含極值點的搜索區間不斷縮短至任意小[5]。本研究結果表明, 利用黃金優選法, 通過3～4個溫度點實驗即可找出小球藻的最佳生長溫度范圍, 是微藻培養條件優化的一種較簡易、有效的方法。

1 材料與方法

1.1 溫度優選實驗設計

首先根據小球藻的生物學特性, 以15～40℃作為小球藻溫度優選的試驗范圍。溫度優選試驗分為幾次進行。第1次實驗: 以15～40℃范圍的0.618處, 即30.5℃作為第1個溫度試驗點, 將其對稱點24.5℃作為第2個溫度試驗點, 比較小球藻在這兩個溫度點的生長狀況, 去掉“劣”點溫度一端部分。第2次實驗: 取已試驗點(“優”點)的對稱點作為第3次試驗點, 在第3次試驗點處試驗, 將其結果與第1次試驗留下的“優”點處試驗結果進行比較, 再去掉“劣”點, 留下“優”點。第3次實驗: 確定在留下部分中該“優”點的對稱點為第4次試驗點, 實驗結果與第2次實驗的“優”點結果比較, 再去 “劣”留 “優”。如此, 每次實驗可以去掉試驗范圍的38.2%, 經過多次試驗, 逐步縮小試驗范圍, 直至取得滿意的結果。

1.2 藻種與培養

實驗藻種小球藻HNC11(Chlorellasp.HNC11)分離自海南大學丘海湖, 小球藻 HNC2(Chlorellasp.HNC2)分離自?？谑邪咨抽T公園。采用不加Si的f／2培養基[6], 單藻種靜止培養。海水取自?？谑邪咨抽T海水浴場, 經過濾后高壓滅菌。培養基pH8.1, 鹽度35。

取指數生長期的藻種按1:5比例接種于5 L玻璃三角瓶中。搖勻后分裝于250 mL三角瓶中, 每瓶200 mL藻液。每個處理(溫度實驗點)4次重復。所有實驗處理培養光強為100 μmol/(m2·s), 光暗周期為12h:12 h, 起始細胞密度為3 × 106個/mL。

1.3 分析方法

1.3.1 生長分析

培養液中小球藻的細胞密度與其在500 nm處的光密度值線性相關[7]。用可見分光光度計(B722s上海棱光技術有限公司)測定小球藻活體藻液的A500值, 據公式(1)換算成細胞密度。

式中,y為每mL藻液細胞數;x為500 nm 處的光密度值。

據公式(2)計算指數生長期的小球藻在1～8 d的相對生長速率。

式中,K為相對生長速率;t1、t2為對應的培養時間;N1和N2分別為t1、t2時期的細胞密度;T為細胞的平均倍增時間。

1.3.2 統計分析

對4次平行試驗結果, 用DPS數據處理系統進行統計分析[8], Duncan新復極差法檢驗各處理間差異。

2 結果與分析

2.1 小球藻HNC11(Chlorella sp.HNC11)溫度優選實驗

實驗結果表明, 小球藻HNC11在15℃和40℃條件下均可生長。靜止培養條件下, 相對生長速率分別為0.11 d-1和0.14 d-1, 細胞倍增時間分別為6.38 d和4.85 d。因而, 以15～40℃作為溫度優選實驗范圍。15～40℃范圍的黃金分割點為30.5℃, 其對稱點為24.5℃, 因此, 首先以30.5℃和24.5℃作為第1次實驗的第1個和第2個溫度實驗點(圖1a), 比較小球藻在兩個溫度條件下的相對生長速率。結果表明, 小球藻HNC11在30.5℃條件下的相對生長速率顯著高于在24.5℃條件下的相對生長速率(P＜0.05,表1)。因此, 30.5℃為“優”點, 24.5℃為“劣”點, 去掉“劣”點一端部分, 則留下部分的溫度區間為24.5～40℃(圖1b)。

以30.5℃在24.5～40℃區間的對稱點34℃作為第3個溫度實驗點, 進行第2次試驗(圖1b), 比較小球藻HNC11在34℃與30.5℃條件下的相對生長速率。為減小不同批次實驗中因藻種生長狀態等非處理因素引起的實驗誤差, 在第2次實驗中同時進行了34℃與30.5℃兩個處理。結果表明, 34℃條件下小球藻HNC11的相對生長速率和平均倍增時間顯著優于(P＜0.05)在30.5℃條件下的(表1), 因此34℃為這個實驗區間的“優”點。去掉“劣點”30.5℃一端, 則可以確定第3次實驗的溫度區間為 30.5～40℃(圖1c)。小球藻在第1和第2次實驗中的3 0.5℃溫度點條件下的相對生長速率無顯著差異(P＞0.05, 表1)。

第3次實驗(圖1c): 第2次實驗的“優”點“34℃”在30.5～40℃溫度區間的對稱點為36.5℃。因而, 以36.5℃為第4個實驗點, 比較小球藻HNC11在34℃和36.5℃條件下的生長速率。結果表明, 小球藻HNC11在兩個溫度條件下的相對生長速率和平均倍增時間無顯著差異(P＞0.05,表1)。因而可以確定其最適生長溫度為34～36.5℃。第2次和第3次實驗中34℃溫度點的小球藻的相對生長速率無顯著差異(P＞0.05, 表1)。

圖1 黃金分割優選法的溫度實驗點 Fig. 1 Temperatures selected with golden section method

2.2 小球藻HNC2(Chlorella sp.HNC2)溫度優選實驗

靜止培養條件下, 小球藻HNC2在15℃和40℃條件下的相對生長速率分別為0.16 d-1和0.14d-1, 細胞倍增時間分別為4.3 d和4.9 d。

第1次實驗(圖1a): 以15～40℃溫度范圍的黃金分割點30.5℃為第1個實驗點, 以其對稱點24.5℃為第2個實驗點, 比較小球藻HNC2在這兩個溫度條件下的生長速率。結果表明, 小球藻HNC2在30.5℃下的相對生長速率顯著高于(P＜0.05)在24.5℃下的相對生長速率(表1)。因此, 30.5℃為“優”點, 24.5℃為“劣”點, 去掉“劣”點一端部分, 則留下部分的溫度區間為24.5～40℃(圖1b)。

第2次實驗(圖1b): 以30.5℃在24.5～40℃區間的對稱點34℃作為第3個溫度實驗點, 比較30.5℃與34℃條件下的相對生長率。結果表明, 34℃條件下, 小球藻HNC2的相對生長速率顯著低于(P＜0.05) 30.5℃條件下的相對生長速率(表1), 34℃條件下與24.5℃條件下的相對生長速率無顯著差異(P＞0.05)。因此, 30.5℃為“優”點, 34℃為“劣”點, 去掉“劣”點一端部分, 則留下部分的溫度區間為24.5～34℃(圖1d)。

第3次實驗(圖1d): 以30.5℃在24.5～34℃區間的對稱點28℃作為第3個溫度實驗點, 進行第2次試驗。結果表明, 30℃條件下, 小球藻HNC2的相對生長速率與28℃條件下的相對生長速率無顯著差異(P＞0.05)。由此推斷, 小球藻HNC2的最適生長溫度為28～30.5℃。

表1 不同溫度條件下小球藻HNC11和HNC2的相對生長速率和平均倍增時間 Tab. 1 Relative growth rate and average generation time of Chlorella sp. HNC11 and Chlorella.sp. HNC2 under different temperature conditions

3 討論

我國著名數學家華羅庚先生從1964年起, 在全國推廣優選法, 利用“0.618優選法”解決了生產實踐中的許多問題[9]。在單因素優選問題中, 黃金分割優選法在選擇配比方法、操作工藝及農業生產方面都起到了重要作用, 不僅減少了試驗成本, 降低了消耗, 而且提高了質量和產量[10-12]。我們實驗結果表明, 應用黃金分割優選法, 可以用較少的實驗次數快速地找到小球藻的最適培養溫度。

在溫度優選實驗中, 為減少誤差, 每次實驗同時做兩個實驗點, 如HNC11的30.5℃實驗點在第1次和第2次實驗中各做了1次。而我們的結果表明, 當藻種的接種密度、培養基和生態因子等培養條件一致時, 小球藻在不同批次的實驗中, 同一溫度下的相對生長速率無顯著差異(P＞0.05)。因此在利用黃金優選法時, 在控制藻種的接種密度、培養基及生態因子等培養條件一致性的情況下, 每個溫度點僅做一次實驗即可, 試驗數將比本次實驗的實驗數減少。如小球藻HNC11在第2次實驗中, 只測定34℃條件下的相對生長率即可, 然后與第1次實驗的“優”點(30.5℃)結果比較即可。因而, 將黃金分割優選法應用在微藻最適培養溫度條件的選擇上, 將顯著地減少實驗次數, 提高優化效率。

小球藻是綠藻門小球藻科中的一個重要屬, 其環境適應強, 分布較廣, 生長快, 易大量培養, 在特定條件下可積累大量油脂[13-14], 因而不但是重要的餌料藻, 也是生產蛋白、色素及制備生物柴油的良好藻種。篩選適應不同生長環境的藻種有利于微藻的開發和利用。溫度優選法的實驗結果表明, 在?？诮逗Ｓ蚍蛛x的小球藻株喜溫耐熱, 適宜在熱帶和亞熱帶地區培養。

[1] 江紅霞, 鄭 怡. 微藻的藥用、保健價值及研究開發現狀 [J].亞熱帶植物科學,2003,32(1):68-72.

[2] Chisti Y．Biodiesel from mieroalgae[J]．Biotechnol Adv, 2007, 25: 294-306．

[3] Huntley M E, Redalje D G．CO2mitigation and renewable oil from photosynthetic microbes: a new appraisal [J]．Mitigation and Adaptation Strategies for Global Change, 2007, 12: 573-608．

[4] Haag A L．Alage bloom again [J]．Nature, 2007, 447: 520-521．

[5] 華羅庚. 優選學[M]．北京: 科學出版社出版, 1981.

[6] Guillard R R, Ryther J H．Studies of marine planktonic diatoms I.CyclotellananaHustedt andDetonula confervacea(Cleve) [J]. Gran Can J Microblol, 1962, 8(2): 229-239．

[7] Liu Z Y, Wang G C, Zhou B C．Effect of iron on growth and lipid accumulation inChlorella vulgaris[J]．Bioresour Technol, 2008, 99: 4717-4722．

[8] 唐啟義, 馮明光. DPS 數據處理系統 [M]. 北京:科學出版社,2007.

[9] 徐偉宣. 華羅庚與優選法統籌法[J]. 高等數學研究, 2006, 8(6): 63- 64.

[10] 崔春紅, 劉亞. 優選法在農業科學試驗中的應用[J]. 畜牧與飼料科學, 2009, 30(4): 185- 186.

[11] 趙迎路, 王月梅. 應用經濟數學方法推動汾酒經濟發展[J]. 釀酒, 2003, 30(3): 8- 9.

[12] 譚杰, 劉羽. 0.618優選法在水電站正常蓄水位優化選擇中的應用[J]. 吉林水利, 2007, 298 (4): 1-2.

[13] 劉志媛, 王廣策. 鐵促進海水小球藻油脂積累的動態過程 [J]. 海洋科學, 2008, 32(11): 56-73.

[14] Illman A M, Scragg A H, Shales S W．Increase inChlorellastrains calorific values when grown in low nitrogen medium[J]．Enzyme Microb Tech, 2000, 27: 631-635.