細角螺微衛星DNA富集文庫構建及特征分析

李清薈, 陳曉姣, 黎中寶, 曹媛鈺, 陳麗娜, 戴 剛

(1. 集美大學 水產學院, 福建 廈門 361021; 2. 福建省海洋漁業資源與生態環境重點實驗室, 福建 廈門 361021)

細角螺(Hemifusus ternatanus)俗稱響螺, 單殼類海產底棲動物, 屬腹足綱(Gastropoda), 新腹足目(Neogastropoda), 盔螺科(Galeodidae), 角螺屬(Hemifusus)。主要分布于中國東南沿海, 新加坡和日本海域。其肉肥, 美味, 具有滋補功能, 經濟價值很高, 是高檔海珍品。近年來, 海域生態環境的惡化以及人類過度捕撈, 細角螺資源日趨衰減。為了防止細角螺進一步衰減, 人們將焦點轉向細角螺的人工育苗及繁殖生物學的研究上, 并且取得初步成功[1], 但仍處在實驗探索階段[2-3]。由于目前對細角螺種質資源現狀了解甚少, 因此對細角螺進行種質資源結構、遺傳多樣性等方面的研究, 這將對保護該物種的野生群體, 開展苗種繁育、良種培育等工作具有重要的意義。

微衛星(microsatellites)DNA, 又稱簡單序列重復(simple sequence repeats, SSR)或短串聯重復序列(short tanderm reapeats, STR), 由中間的核心序列與其兩端的保守側翼序列組成, 核心序列為1～6個核苷酸為重復單元的串聯重復DNA序列。由于微衛星分子標記具有多態性豐富, 穩定性好, 符合孟德爾遺傳和具有共顯性[4]等特點, 自1984年被Tautz等[5]首次提出可用于群體遺傳學研究后, 該技術就被廣泛應用于動植物的遺傳多樣性, 遺傳變異, 遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構建等方面。如斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)[6], 大珠母貝(Pinctada maxima)[7]及 許 氏 平 鲉 (Sebastes schlegeli)[8]等 都 得 到很好的應用。細角螺作為重要的經濟貝類之一, 目前有關細角螺微衛星分子標記的研究尚未見報道。本研究采用磁珠富集法構建細角螺微衛星富集文庫, 并分析微衛星序列的特征, 為進一步篩選大量的微衛星引物奠定基礎, 進而為研究細角螺遺傳多樣性, 遺傳圖譜構建, 人工育苗等提供一定的基礎資料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細角螺樣品采自福建省泉州市惠安縣。

1.2 基因組DNA提取與酶切

根據上海生工生物工程技術有限公司的基因組小量抽提試劑盒(SK1252)提供的步驟, 稍做修改提取細角螺基因組DNA。所提DNA經1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-20℃保存備用。用MseI酶切基因組DNA, 選取長度為300～1200bp的酶切片段進行連接。

1.3 接頭制備與連接

等體積混合與MseI酶切部位相匹配的Linker A(5'-GACGATGAGTCCTGAG-3')及LinkerB (5'-TAC TCAGGACTCAT-3'), 95℃變性10 min, 37℃10min, 最后冰置10min, 形成終濃度為10 μmol/L的雙鏈接頭待用。

連接體系30 μL: 酶切產物20μL, 接頭5μL(10 μmol/L), T4連接酶(5 U/μL)1μL, 10×T4 buffer 4 μL于37℃連接3.5h或22℃連接過夜。

1.4 探針雜交

雜交反應前, 先將2×Hyb buffer(雜交緩沖液)預熱至 55℃備用, 將接頭連接產物95℃變性10 min。取變性后的連接產物與 bio-(CT)15、bio-(GT)15混合探針進行雜交反應, 雜交反應體系為50 μL,其中包括25 μL 2×Hyb buffer, 10 μL接頭連接產物, 5 μL Bio-(CT)15(10μmol/L), 5 μL Bio-(GT)15(10 μmol/L) 以及5 μLddH2O。61℃反應1h后, 放置4℃備用。

1.5 磁珠的平衡

取150 μL磁珠原液于1.5 mL離心管中, 混勻后置于磁力架上捕獲磁珠, 小心吸走上清液。用150μL(等比例)0.5×SSC洗滌磁珠兩次, 然后將磁珠重懸于150 μL的6×SSC, 0.1% SDS中。

1.6 磁珠富集及精制

將50 μL雜交產物與重懸磁珠混勻, 室溫下溫育30 min, 期間以每 1～2 min翻轉1次, 以使生物素和鏈霉親和素結合, 30 min后將離心管置于磁力架上, 吸去上清液。然后將離心管放置于磁力架上洗滌。室溫下, 用400 μL洗液I(2×SSC, 0.1% SDS)洗脫2次, 400 μL洗液Ⅱ(1×SSC, 0.1% SDS)在室溫下洗脫2次, 再用洗液Ⅱ于50℃洗脫兩次, 將不含微衛星的序列除去, 然后用200 μL的0.1×TE于95℃溫育10 min后迅速吸取上清液至新管。加入400 μL經-20℃預處理的無水乙醇, 并加入 20 μL NaAc/EDTA(pH8.0)螯合劑, 冰上靜置15 min后冷凍離心, 棄乙醇, 加入500 μL經-20℃預處理的75%乙醇, 冰上放置15 min后冷凍離心10 min, 棄乙醇, 風干樣品。最后加入25 μL TE溶液, 放置4℃過夜, 使微衛星DNA充分溶解于TE溶液中。

1.7 PCR擴增及純化

以寡聚核苷酸鏈MseIadapterA為引物對上述精制到的微衛星DNA片段進行PCR擴增, 25 μL反應體 系 包 括 10×Buffer(含 Mg2+) 4 μL, dNTP (10mmol/L)0.4 μL, Taq聚 合 酶(5U/μL), 0.2 μL,MseI-A引物1.4 μL (10 μmol/L), 17 μL ddH2O, 精制產物2 μL。PCR反應條件為: 95℃預變性2 min, 20×(95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 60 s), 最后72℃保持10 min完成擴增片段的末端加尾A。用0.1%瓊脂糖檢測PCR擴增產物的片段大小。產物用GenClean PCR回收試劑盒(上海捷瑞)純化以除去多余的dNTPs及接頭等雜質。

1.8 微衛星DNA片段克隆、篩選和序列分析

將純化的PCR產物用pMD19-T載體于16℃連接4h。用感受態大腸桿菌DH5α進行轉化克隆, 得到細角螺微衛星文庫。挑取單克隆于LB液體培養基中, 37℃振蕩培養過夜。用M13F/R通用引物對單克隆菌進行PCR檢測, 挑取片段大于等于500 bp的陽性克隆的菌液送至華大基因測序。

2 結果

2.1 克隆及測序結果

經PCR篩選, 在354個陽性克隆中有248個含有大小合適的插入片段, 片段大小為500～1000bp, 從中隨機挑選220個克隆送出測序。圖1為部分篩選結果的電泳圖。

圖1 單克隆檢測結果 Fig. 1 Result of the monoclonal detection

依據Linda等[9]對微衛星的劃定標準: 單核苷酸重復大于15次, 二核苷酸重復大于7次, 三核苷酸大于5次, 四核苷酸及五核苷酸大于4次。序列比對后用SSR hunter軟件進行微衛星序列的查找, 結果表明在成隆功測序的220個陽性克隆中, 除5個不含有微衛星序列外, 在剩余的215個克中共得到278個重復次數在5以上的微衛星序列。依據Weber制定的標準[10], 在本研究篩選到的278個細角螺微衛星序列中, 完美型171個, 占61.5 %, 非完美型80個, 占29.1%, 復合型26個, 占9.4%(表1)。除探針使用的GT和CT的重復序列外, 還篩選到三堿基GTT、TGG、GAA、CAA; 四堿基TCTA、ACAG、TAGA、GTGA、GTCT、GATA及五堿基TTTTG的重復序列, 具體統計見表2。

表1 細角螺基因組微衛星序列的分類情況 Tab.1 Classification of microsatellites for H. ternatanus

表2 部分微衛星序列的重復單元、重復類型及序列號情況 Tab.2 The repeat motifs, category and genebank accession number of part of microsatellite sequences

2.2 克隆測序峰圖

在測序的220個陽性克隆中, 有156個單向測序不能測通, 占所有克隆的70%, 需再用載體的反向引物來測序,才能測序成功。并且這部分的測序結果顯示, 在單個克隆中有多處微衛星重復序列, 有的甚至高達6處, 并且出現復雜的堿基重復。這可能是導致測序過程出現信號衰減, 測序峰圖紊亂的原因。圖2為單向測序測通的某克隆部分峰圖。

圖2 XL46位點部分微衛星測序峰圖 Fig. 2 Part of the microsatellite sequencing peak figure in XL46 loci

3 討論

被用于微衛星分子標記的生物素探針有多種, 可根據研究對象的特點來選擇相應的探針。在所有動物基因組中(CA)n微衛星的含量最為豐富, 其次是(CT)n微衛星[11], 故本實驗在用(GT)15探針的基礎上又采用了(CT)15探針, 以期獲得更多的標記位點。在真核生物基因組中, 雙核苷酸重復的微衛星DNA最為豐富, 三核苷酸重復的微衛星DNA比雙核苷酸重復微衛星DNA的含量低10倍, 四核苷酸重復的微衛星DNA與之相比, 含量更少[12]。本研究的結果顯示細角螺基因組DNA中二堿基重復的微衛星序列(84.53%)含量最高, 這與研究報告的結論相一致, 而四堿基重復的微衛星序列(9.71%)比三堿基重復的微衛星序列(5.4%)所占的比例更高, 與報告過的研究結果相反。原因可能是雜交時采用(GT)15、(CT)15混合探針, 導致在總的278個微衛星片段中出現多達21個GTCT以及與之相互補的CAGA重復序列。本研究獲得的細角螺微衛星中, 完美型所占比例為61.7%, 與蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis) 50.18%[13], 企鵝珍珠貝(Pteria penguin)65.5%[14], 合浦珠母貝(Pinctada martensii)77.3%[15], 大珠母貝(Pinctada maxima)63%[7]及西施舌(Coelomactra antiquate)68.4%[16]等貝類基本相似, 都是完美型所占的比例更高, 而混合型所占的比列(9.4%)與李琪等[17]研究的長牡蠣(Crassostrea gigas)的混合型比例(24.2%)相差很大。這些不同的結果與研究方法和篩選富集得到的不同微衛星區域有關, 同時也在一定程度上反映了貝類基因組微衛星的特性。

微衛星核心序列突變率相對較高, 造成了微衛星核心序列重復次數的變化, 這是微衛星多態性的基礎[18]。Valdes[19]認為重復次數低于5 的微衛星幾乎檢測不出多態性, 一般微衛星重復次數程度與多態性程度成正相關[20]。本實驗所得序列重復次數多集中在7～30, 占62%, 最高達到64次。理論上講, 本研究所得的細角螺微衛星序列中,應該有約60%的序列可以設計的引物。但是由于一條克隆中出現多處微衛星序列, 最高高達6處, 并且出現復雜的堿基重復, 導致測序峰圖紊亂以及引物設計困難, 在278條序列中僅有82條可以設計引物, 并且質量較高的僅有50條。原因可能是在富集過程中多次洗滌磁珠, 使得一個克隆里有多個重復序列片段, 保守序列堿基數少, 導致引物設計和篩選困難。另一個原因可能是細角螺基因組中的微衛星本來就比較復雜, 與多數貝類遺傳背景一樣, 在進化過程中發生染色體重排[21],導致基因組結構復雜和存在多個位點,從而對引物的設計及篩選產生影響。

目前國內對細角螺的研究主要集中在幼苗繁育[1-2]及生理生化上[22], 國外主要集中在幼螺生長的生態習性[23]、神經鞘脂類的組成和結構[24-27]、體內的砷分布[28], 對其遺傳多樣性的研究較少, 僅在核型特征[29]方面有所報道。本研究構建細角螺進行微衛星富集文庫及分析其序列組成, 為進一步篩選大量的微衛星引物奠定基礎, 以期為保護細角螺野生群體、開展苗種繁育, 種苗放流及良種培育等工作提供理論參考的目的。

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