阿米洛利對大鼠面部炎性痛行為反應的影響

陳曉青，黃 丹，柳 威，楊 榮

（江漢大學 醫學院，湖北 武漢 430056）

酸敏感離子通道（Acid－sensing ion channels，ASICs）是一類由胞外酸化所激活的陽離子通道，在中樞和外周神經系統中都廣泛表達，已有的實驗結果證實，外周神經系統的ASICs 與疼痛的產生和傳導密切相關［1］。

由于炎癥、組織酸化和痛覺三者之間密切的聯系，外周的ASICs 作為酸感受器可能與炎性痛相關。當注射酸性溶液至人體皮膚中可直接導致皮下組織酸化并伴隨灼熱痛的產生，并且痛的程度也與酸性強度呈正相關。與此相一致的是ASICs 在脊髓背根（DRG）神經元中的傷害性感受器上有著豐富的表達。研究發現，炎癥可導致DRG 神經元中的ASICs 表達顯著增加，而非甾體類抗炎止痛藥如阿司匹林等可以對抗DRG 神經元ASICs 表達的增加，也可以直接抑制ASICs 介導的電流［2］。三叉神經節（TG）是和DRG 類似的一種外周感覺神經節，它是頭面部外周信息傳導到腦干的中繼站，在TG 神經元上也有對酸刺激敏感的ASICs 的mRNA 的表達［3］。本研究在大鼠面部炎癥痛模型的基礎上，通過藥理學結合行為學方法，來探討ASICs 在Formalin 誘導的頭面部炎癥自發痛中的作用，為三叉神經痛的發病機制和藥物治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物的使用和相關實驗獲得江漢大學醫學倫理學委員會批準。成年SD 雌性大鼠40 只，體重250～300 g，常規條件下飼養，自然晝夜；自由飲水、取食。大鼠在檢測之前的5 d 每天對周圍的實驗室環境以及檢測的盒子適應至少30 min。實驗操作都在室溫（20 ± 1）℃下進行。動物購自湖北省實驗動物研究中心，動物飼養合格證號：00012239。

1.2 5% Formalin 溶液的配制

取37%Formalin 0.5 mL，加入生理鹽水9.5 mL。

1.3 炎癥痛模型的制備與行為學觀察

本實驗嚴格按照國際疼痛學會（AISP）關于使用動物進行疼痛實驗研究綱要的要求實施和完成。藥物注射前，將大鼠提前30 min 置于觀察箱中去適應實驗環境。大鼠上唇皮下注射致炎劑5%的福爾馬林50 μL 造成無菌性炎癥，注射的大致部位見圖1。對照組動物則注射等量溶劑。注射后，立即把動物放在觀察箱中，以動物抓搔注射部位的時間（s）為痛敏行為觀察指標，觀察記錄45 min，共分成15 節，以每節3 min 為一觀察評分時段，每節疼痛程度按計時（s）評分。

圖1 藥物在面部的大致注射區域

1.4 實驗分組

將實驗動物隨機分為5 組：正常對照組、炎癥痛模型組、10 μg、30 μg 和100 μg Amiloride（Calbiochem 公司產品）組，8 只/ 組，每只大鼠僅被使用一次，實驗結束后以過量的麻醉藥處死。對照組：右側上唇皮下注射生理鹽水（50 μL）前5 min，該部位注射50 μL 溶劑。炎性痛模型組：右側上唇皮下注射Formalin（50 μL）前5 min，該部位注射50 μL 溶劑。Amiloride 組：在Formalin注射前5 min，右側上唇皮下注射相應劑量的Amiloride 50 μL。

1.5 數據統計

所有數據以Mean ± Ssem表示。不同組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 頜面部2.5% Formalin 皮下注射可誘發典型的傷害性感受反應

生理鹽水對照組偶有個別的擦面行為（自然的生理行為）。5% Formalin 注射后動物有明顯的自發痛行為反應，注射后即刻出現快速的用前（或后）爪抓擦頜面注射區的疼痛行為反應，持續約0 ～3 min，3 ～12 min 相對平靜，12 ～36 min 時間段又出現明顯而且集中的抓擦行為反應，36 ～45 min 僅可見少量的抓擦行為反應。在0 ～3 min和12 ～36 min 各觀察時間段，生理鹽水對照組和Formalin 炎性疼痛組洗面的持續時間差異有統計學意義（P ＜0. 05，圖2）。除抓擦注射部位外，Formalin 炎性疼痛組動物在注射Formalin 溶液的前3 min 內還有跳躍、尖叫、軀體震顫等其他傷害性行為反應。

2.2 Amiloride 對Formalin 誘導的自發痛的有抑制作用

圖2 對照組、福爾馬林炎癥痛模型組搔抓活動的時程圖

在注射福爾馬林5 min 前，大鼠上唇皮下注射不同劑量的Amiloride，發現Amiloride 對Formalin 誘導的第二相傷害性反應的抑制作用有劑量依賴性。如圖3 所示，與Formalin 組相比，10 μg Amiloride 組沒有明顯的縮短面部炎性疼痛大鼠各時相洗面的持續時間（P ＞0. 05）；30 μg Amiloride 組可明顯減少大鼠福爾馬林誘導的第二相（12 ～21 min）的洗面的持續時間（P ＜0. 05），對第一相洗面的持續時間無明顯影響；100 μg Amiloride 對福爾馬林誘導的第二相的洗面的持續時間的抑制作用可延長到12 ～27 min（P ＜0. 05）。在Formalin 注射后的15 ～18 min 這個時間段，福爾馬林對照組動物洗面的持續時間為（57. 8 ± 10. 6）s，而30 μg Amiloride 預先處理組動物洗面的持續時間為（27. 7 ± 5. 8）s，100 μg Amiloride 預先處理組動物洗面的持續時間為（22.3±6.3）s。

圖3 福爾馬林炎癥痛模型組和皮下注射不同劑量的阿米洛利（10 μg、30 μg 和100 μg）組搔抓活動的時程圖

3 討論

福爾馬林實驗是最先由Dubuisson 和Dennis于1977 年引入疼痛研究的動物模型，對貓、鼠后爪皮下注射稀釋的福爾馬林可誘導傷害性自發疼痛，動物對福爾馬林刺激產生的行為反應，典型的時間過程為2 個時相［4］。1989 年Clavelou 等［5］將福爾馬林實驗應用于頜面部疼痛的動物實驗中，并認為抓擦（rubbing or grooming）注射部位皮膚是一可靠的、具有可比性的傷害性行為，這一行為持續時間的長短可作為評價三叉神經系統受傷害性刺激后產生疼痛的強度的可靠方法［6］。在本研究中，Formalin 炎性疼痛組的傷害性行為反應也呈典型的2 個時相，說明頜面部注射福爾馬林后，產生的疼痛行為反應是一種穩定的，可重復的傷害性行為，故可應用于頜面部疼痛的研究。

在外周，ASICs 已被廣泛認為是一種傷害性感覺的受體，它直接參與了組織酸化所誘導的痛覺。初級感覺神經元可以通過ASICs 來感受外周的組織酸化，酸誘發的經ASICs 介導的電流（Iacid）能使初級感覺神經元去極化甚至產生一連串的動作電位，從而導致疼痛的產生。福爾馬林實驗兩期傷害性行為變化分別涉及不同的致痛機理［7］。實驗表明P 物質和緩激肽參與第一期反應，而在第二期則有組織胺、5－羥色胺、前列腺素和緩激肽的參與［8］。本實驗結果發現，在注射Formalin之前，皮下之前注射ASICs 的拮抗劑Amiloride 可劑量依賴性地抑制Formalin 誘致的持續性自發痛的第二相的反應，說明ASICs 參與Formalin 誘致的面部炎性自發痛二期的產生。目前研究發現在TG 上至少有ASIC1b 和ASIC3 的表達［9］，在Formalin 誘導的面部炎性疼痛模型中，到底是ASIC1b或者是ASIC3 或兩組均參與Formalin 誘導的炎性疼痛還有待于進一步的研究證實。

［1］ Gu Q，Lee L Y. Acid－sensing ion channels and pain［J］.Pharmaceuticals，2010，3（5）：1411－1425.

［2］ Voilley N. Acid－sensing ion channels（ASICs）：new targets for the analgesic effects of non－steroid anti－inflammatory drugs（NSAIDs）［J］. Current Drug Targets－Inflammation& Allergy，2004，3（1）：71－79.

［3］ Ugawa S，Ueda T，Yamamura H，et al. Coexpression of vanilloid receptor subtype－1 and acid－sensing ion channel genes in the human trigeminal ganglion neurons［J］.Chem Senses，30（Suppl 1）：i195.

［4］ Dubuisson D，Dennis S G. The formalin test：a quantitative study of the analgesic effects of morphine，meperidine，and brain stem stimulation in rats and cats［J］.Pain，1978，4：161－174.

［5］ Clavelou P，Pajot J，Dallel R，et al. Application of the formalin test to the study of orofacial pain in the rat［J］.Neuroscience Letters，1989，103（3）：349－353.

［6］ Raboisson P，Dallel R. The orofacial formalin test［J］.Neuroscience & Biobehavioral Reviews，2004，28（2）：219－226.

［7］ 張立生，劉小立. 現代疼痛學［M］. 石家莊：河北科技出版社，1999：159－163，175.

［8］ Cadden S W，Orchardson R. The neural mechanisms of oral and facial pain［J］. Dent Update，2001，28：359－367.

［9］ Liu L，Simon S A. Capsaicin，acid and heat－evoked currents in rat trigeminal ganglion neurons：relationship to functional VR1 receptors［J］. Physiology & Behavior，2000，69（3）：363－378.