迷迭香酸對(duì)輻射損傷小鼠造血功能的保護(hù)作用

張玉杰，李光強(qiáng)，徐文清 ，沈 秀，施培基

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所 天津市分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300192

輻射防護(hù)劑是一類(lèi)在照射前或在照射后早期使用，能夠減輕輻射對(duì)機(jī)體造成的損傷，促進(jìn)損傷恢復(fù)的藥物。在電離和非電離等輻射接觸中，它扮演著重要的角色。20 世紀(jì)50 年代，輻射防護(hù)劑迎來(lái)了研究的高潮時(shí)期，70 年代以后，因?yàn)楹藨?zhàn)威脅趨于緩和而逐漸低迷。近年來(lái)，航天航空事業(yè)飛速發(fā)展，輻射防護(hù)劑的研究又被提上日程。因此，安全、廣譜的輻射防護(hù)藥物研究不僅對(duì)醫(yī)療事業(yè)亦對(duì)航天航空事業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

一直因強(qiáng)抗氧化活性而廣泛用于食品、化妝品行業(yè)的迷迭香酸，由于安全及藥效廣譜而成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。它具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓和抗血小板凝聚、抗腫瘤、改善和增強(qiáng)認(rèn)知能力及治療過(guò)敏性疾病等眾多藥理作，化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。最新研究發(fā)現(xiàn)的對(duì)抗紫外線輻射［1］和降低60Co γ 射線導(dǎo)致的骨髓細(xì)胞中嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率等功效［2］，引起了筆者的興趣。本研究探索迷迭香酸對(duì)亞致死劑量輻射損傷小鼠造血功能的保護(hù)作用。

圖1 迷迭香酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of rosmarinic acid

1 材料與儀器

1.1 藥品和試劑

迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)購(gòu)自Sigma;阿米福汀(Amifostine，WR-2721)購(gòu)自大連美羅大藥廠;碳酸氫鈉、無(wú)水氯化鈣、冰醋酸、高氯酸，購(gòu)自津市江天化工技術(shù)有限公司;氯化鈉注射液購(gòu)自中國(guó)大冢制藥有限公司;乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2Ka)購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器

137Cs γ 射線照射源(Gammacel 40，加拿大);BC-2800 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(邁瑞，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司);正置熒光顯微鏡(Qlympus BX53，美國(guó));離心機(jī)(TDZ5-WS，湘儀離心機(jī)儀器有限公司);電子精密天平(METTLER TOLEDO，美國(guó))。

1.3 動(dòng)物

健康SPF 級(jí)ICR 小鼠，由天津市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(津)2010-0002。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

6～7 周齡ICR 小鼠，70 只，體重18 ± 2 g，雌雄各半，隨機(jī)分為7 組:正常組;單純照射組(IR )給予生理鹽水;陽(yáng)性對(duì)照組(WR-2721)于照射前0.5 h腹腔注射WR-2721 200 mg/kg b. w.;迷迭香酸(RA)50、100、150、200 mg/kg 劑量組分別給予RANa(迷迭香酸鈉鹽)50、100、150、200 mg/kg b. w.。IR 組與RA 各劑量組均于照射前2、1 日連續(xù)口服給藥0.3 mL/只，照射當(dāng)日，于照射前20 min 給藥;照射后連續(xù)給藥6 日，均每日一次。137Cs γ 射線一次性全身照射，照射劑量率71.1 rad/min，小鼠吸收劑量為5.5 Gy。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三批。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 體重

取照射前2 日，照射當(dāng)日，照射后2、4、6 日等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)各組小鼠稱(chēng)重，觀察體重變化。于照射后第7 日，處死之前稱(chēng)取各組小鼠體重。

2.2.2 臟器系數(shù)

照射后第7 日，稱(chēng)得小鼠體重，然后頸部脫椎處死。取脾臟和胸腺，稱(chēng)重，按下式計(jì)算臟器系數(shù):

2.2.3 外周血指標(biāo)

照射后第7 日，小鼠摘眼球取血約1 mL，加入20 mg/mL EDTA-2Ka 的生理鹽水溶液100 μL，BC-2800 全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、血小板(blood pelet，PLT)數(shù)目及血紅蛋白(hemoglobin，HGB)濃度。

2.2. 4 股骨有核細(xì)胞數(shù)(bone marrow nucleated cells，BMNC)

于照射后第7 日，將小鼠頸部脫椎處死，取一側(cè)股骨，用白細(xì)胞稀釋液沖洗骨髓，后于熒光顯微鏡下觀察股骨有核細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

2.2.5 脾結(jié)節(jié)(colong forming unit of spleen，CFUS)

將取出的脾臟放入Bouin 液內(nèi)固定，約24 h 后，取出，用酒精沖洗去大部分黃色，肉眼計(jì)數(shù)突出脾臟表面的結(jié)節(jié)數(shù)(CFU-S)。

2.2.6 骨髓DNA 含量

照射后第7 日，小鼠頸部脫椎處死后取一側(cè)股骨，用0.005 mol/L CaCl2溶液沖洗骨髓，離心，棄上清液，加入0.2 mol/L 高氯酸溶液5 mL，充分混勻，90 ℃加熱15 min，冷卻，過(guò)濾，濾液于268 nm 處測(cè)定吸光度值(A)。DNA(μg)= 40 ×50 ×A

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以表示，不同實(shí)驗(yàn)組間差異采用單因素ANOVA 方差分析檢驗(yàn)，SPSS17.0 軟件處理，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 不同劑量RA 對(duì)γ 射線照射后小鼠體重的影響

137Cs γ 射線照射前，各組小鼠毛色及活動(dòng)正常，體重增加。照射后，正常對(duì)照組因沒(méi)有受到輻射仍保持正常;IR 及RA 各劑量組均出現(xiàn)不同程度的梳毛光澤性下降、精神萎靡、飲食和飲水量下降;WR-2721 組的毛色及活動(dòng)狀況幾與正常對(duì)照組無(wú)異。

在照射前第2 日(-2)、照射當(dāng)日(0)、照射后第2(+2)、4(+4)、6(+6)日對(duì)小鼠稱(chēng)重，各組小鼠體重變化趨勢(shì)見(jiàn)圖2。照射前，各組小鼠體重保持近相同程度的增長(zhǎng)(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。照射后，體重明顯下降，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(P ＜0.01);RA 100 mg/kg 組體重下降較緩和，與IR 組呈顯著差異(P ＜0.01)。WR-2721 組于照后第4日體重顯著恢復(fù);如表1 所示，RA 各劑量組在第6日表現(xiàn)出不同程度的恢復(fù)，除RA 200 mg/kg 組外，其余各組均較IR 組有顯著性差異，且與WR-2721組無(wú)明顯區(qū)別(P ＞0.05)，但是RA 100 mg/kg 組恢復(fù)尤佳(P ＜0.001)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RA 能夠促進(jìn)輻射損傷小鼠體重的恢復(fù)，給予小鼠迷迭香酸鈉鹽100 mg/kg 能夠很好的減輕輻射引起的體質(zhì)量下降。

3.2 不同劑量RA 對(duì)受照小鼠臟器系數(shù)的影響

γ 射線照射后，小鼠脾臟和胸腺?lài)?yán)重受損，WR-2721 及RA 起到了保護(hù)作用，見(jiàn)圖3。RA 100 mg/kg 對(duì)脾臟保護(hù)作用明顯(P ＜0.01)，與WR-2721組無(wú)顯著性差異(P = 0. 936)。RA 50、150、200 mg/kg 等劑量亦能升高脾系數(shù)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)。在對(duì)免疫器官胸腺的保護(hù)方面，給藥組明顯好于IR 組，除RA 200 mg/kg 外，其余各劑量有顯著性差異，組間差異無(wú)顯著性(P ＞0.05)，但是RA 100 mg/kg 效果最好(P ＜0.001)。從圖3、4 中可見(jiàn)，RA 對(duì)輻射損傷小鼠脾和胸腺的保護(hù)效果并非如預(yù)計(jì)呈劑量依賴(lài)性。

圖2 137Cs γ 射線照射前2 d(-2)至照射后第6 d(+6)小鼠體重變化趨勢(shì)Fig.2 Trends of mice's weight from the 2nd day before(-2)irradiation to the 6th day after irradiation(+6)

表1 RA 對(duì)輻射損傷小鼠體重的影響(n=30，±s)Table 1 Influence of RA on weight of mice exposed to 5.5 Gy γ-rays (n=30，±s)

表1 RA 對(duì)輻射損傷小鼠體重的影響(n=30，±s)Table 1 Influence of RA on weight of mice exposed to 5.5 Gy γ-rays (n=30，±s)

注:與單純照射組(IR)比較，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001

組別Group實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)小鼠體重(g)Weight of mice at the beginning of the experiment(g)照射后第6 天小鼠體重Weight of mice on the 6th day after irradiation(g)(g)正常對(duì)照組(Normal group)20.31 ±0.51 27.33 ±2.39 IR 20.67 ±1.03 19.72 ±1.54 WR－2721 20.57 ±0.85 22.02 ±1.98＊＊＊RA 50 20.68 ±1.22 21.10 ±1.27*RA 100 20.95 ±1.04 22.12 ±1.84＊＊＊RA 150 20.49 ±1.16 21.03 ±1.87*RA 200 20.85 ±1.03 20.30 ±1.30

3.3 不同劑量RA 對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的影響

如表2 所示，5.5 Gy γ 射線照射后，小鼠造血系統(tǒng)嚴(yán)重受損，股骨DNA 含量、股骨有核細(xì)胞數(shù)目(BMNC)及外周血指標(biāo)(WBC、HGB、PLT)明顯低于正常組，脾臟應(yīng)急反應(yīng)出現(xiàn)結(jié)節(jié)(CFU-S)。數(shù)據(jù)顯示，RA 不同劑量組均對(duì)受照小鼠造血系統(tǒng)有一定的保護(hù)作用。與IR 組相比，RA 能有效的升高外周血白細(xì)胞(WBC)數(shù)目，除200 mg/kg 組統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無(wú)顯著性，50(P ＜0.01)、100(P ＜0.01)、150(P＜0.05)mg/kg 均有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)給予受照小鼠RA 后，小鼠外周血載氧能力明顯提高，RA 50(P＜0.05)、100(P ＜0.01)、150(P ＜0.05)mg/kg 組血紅蛋白(HGB)含量與IR 組相比有顯著或極顯著性差異，外周血血小板(PLT)含量亦顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.001，P ＜0.01，P ＜0.05)。

表2 不同劑量RA 對(duì)γ 射線損傷小鼠外周血相的影響(n=30，±s)Table 2 Influence of RA on the peripheral blood of γ-rays irradiated mice at different Concentrations (n=30，±s)

表2 不同劑量RA 對(duì)γ 射線損傷小鼠外周血相的影響(n=30，±s)Table 2 Influence of RA on the peripheral blood of γ-rays irradiated mice at different Concentrations (n=30，±s)

注:與IR 組比較，* P ＜0.05;＊＊ P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001

組別Group WBC(×109/L)HGB(g/L)PLT(×109/L)正常對(duì)照組(Normal group)5.36 ±1.31 103.88 ±5.83 352.60 ±29.82 IR 0.78 ±0.27 91.89 ±7.68 126.71 ±32.62 WR-2721 2.16 ±0.53＊＊＊ 94.22 ±5.82 196.00 ±42.02＊＊＊RA 50 1.08 ±0.36＊＊ 96.28 ±7.69* 154.26 ±39.68*RA 100 1.11 ±0.32＊＊ 97.27 ±6.04＊＊174.00 ±43.76＊＊＊RA 150 1.06 ±0.33* 96.56 ±3.78* 165.13 ±22.14＊＊RA 200 0.86 ±0.26 94.89 ±5.77 150.63 ±39.43*

表3 不同劑量RA 對(duì)γ 射線損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)作用(n=30，±s)Table 3 Protective effect of RA on the hematopoietic system of γ-rays irradiated mice at different concentrations (n=30，±s)

表3 不同劑量RA 對(duì)γ 射線損傷小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)作用(n=30，±s)Table 3 Protective effect of RA on the hematopoietic system of γ-rays irradiated mice at different concentrations (n=30，±s)

注:與IR 組比較，* P ＜0.05;＊＊ P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001

組別Group DNA(μg/根股骨)BMNC(×106/根股骨)CFU-S(個(gè)/脾)正常對(duì)照組(Normal group)2804 ±290 18.97 ±3.12 0 IR 1426 ±471 9.19 ±4.27 38.71 ±19.64 WR-2721 2410 ±468＊＊＊59.94 ±14.55＊＊＊RA 50 1868 ±448＊＊20.77 ±5.48＊＊＊56.60 ±15.51＊＊RA 100 2116 ±353＊＊＊15.80 ±3.12＊＊＊63.38 ±16.69＊＊＊RA 150 2012 ±621＊＊＊17.56 ±4.30＊＊＊55.94 ±14.93＊＊RA 200 1569 ±537 15.80 ±4.92＊＊＊14.08 ±4.90＊＊55.36 ±16.01＊＊

基于RA 能夠如此明顯的促進(jìn)外周血相的恢復(fù)，我們進(jìn)而探討了RA 對(duì)造血系統(tǒng)的影響。研究顯示RA 各劑量組的股髓DNA 含量、股髓有核細(xì)胞數(shù)(BMNC)、內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)數(shù)(CFU-S)均高于IR組，但并不呈劑量依賴(lài)性。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理發(fā)現(xiàn)，RA 各組BMNC、CFU-S 較IR 組呈顯著性差異(P ＜0.01)，而骨髓DNA 含量，與IR 比較，除200 mg/kg外，其他劑量亦有顯著性差異(P ＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，RA 50～200 mg/kg 對(duì)輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)有很好的保護(hù)作用，劑量為100 mg/kg 時(shí)，效果最佳。

4 討論

電離輻射作用于機(jī)體后在瞬間以其很小的能量引發(fā)一系列物理、化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生一系列生物效應(yīng)，表現(xiàn)出輻射損傷，如體重下降，免疫和造血等輻射敏感器官受損，活動(dòng)能力降低等。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，輻射導(dǎo)致的免疫障礙使機(jī)體處于對(duì)病原體及其他損傷因子的高敏抵抗?fàn)顟B(tài)，增加了繼發(fā)感染和死亡幾率。因此胸腺和脾臟的正常與否直接關(guān)乎生命安危。脾系數(shù)和胸腺系數(shù)反映了生物體免疫功能，實(shí)驗(yàn)中選取二者作為評(píng)價(jià)RA 對(duì)受照小鼠免疫系統(tǒng)影響的指標(biāo)。造血系統(tǒng)對(duì)射線極具敏感性，骨髓是主要的造血組織，亦是輻射攻擊的重要目標(biāo)。骨髓受到射線照射后，在分子、細(xì)胞水平上產(chǎn)生多方面病理變化，造成DNA 斷裂，造血干細(xì)胞急劇減少，故使外周血中白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板降低。而CFU-S 和BMNC 也代表了機(jī)體造血組織恢復(fù)的能力。實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)定小鼠外周血中WBC、PLT、HGB 及骨髓DNA 含量、BMNC、CFU-S 以研究不同劑量RA 對(duì)γ 射線照射后小鼠造血系統(tǒng)的影響。

因近年來(lái)，核能應(yīng)用逐漸深入到人類(lèi)生活的各個(gè)方面，“神九”等載人航天飛船升空，以及宇航員的太空行走和空間站的建立，人類(lèi)受到射線輻射的幾率日趨升高。目前，WR-2721(氨磷汀)是國(guó)際上普遍認(rèn)可的廣譜細(xì)胞保護(hù)劑，被FDA 批準(zhǔn)與順鉑聯(lián)用治療腫瘤，但因其毒副作用嚴(yán)重而沒(méi)有被批準(zhǔn)為輻射防護(hù)藥。研究稱(chēng)其能降低行為能力［3，4］，對(duì)鈣離子代謝的影響會(huì)加重人在太空中失重引起的低血鈣［5］，還有其他如惡心、嘔吐、低血壓等一系列副作用。因此，研制高效低毒的輻射防護(hù)劑意義重大。

實(shí)驗(yàn)于γ 射線照射前給小鼠連續(xù)2 d 口服不同劑量的迷迭香酸鈉鹽溶液(RA-Na)，并于照射當(dāng)天照射前20 min 再口服給藥一次，5.5 Gy137Cs γ 射線一次性全身照射后，連續(xù)給藥6 d。從實(shí)驗(yàn)中可以看出，相比單純照射組(IR)，迷迭香酸(RA)組小鼠體重于照射后第5 d 便開(kāi)始恢復(fù)，而IR 組在第7 天仍不見(jiàn)上升，并且第7 d RA 組體重與IR 組有顯著性差異。體重是機(jī)體整體狀況的一個(gè)表征，迷迭香酸能夠促進(jìn)受照小鼠體重恢復(fù)，初步表明其有一定的抗輻射效果。試驗(yàn)進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，RA 50～200 mg/kg能夠防止小鼠胸腺和脾臟系數(shù)降低，有效地保護(hù)免疫器官，這與研究稱(chēng)其具有免疫調(diào)節(jié)功能相映成輝［6，7］。RA 對(duì)小鼠造血系統(tǒng)的保護(hù)也是出乎意料，它能夠顯著升高輻射損傷小鼠外周血白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)數(shù)目，提高血紅蛋白(HGB)濃度，保護(hù)骨髓組織，避免射線導(dǎo)致的骨髓細(xì)胞DNA 斷裂、骨髓有核細(xì)胞減少，并且促進(jìn)內(nèi)源性脾結(jié)節(jié)(CFU-S)形成，增強(qiáng)脾臟造血功能。從迷迭香酸化學(xué)結(jié)構(gòu)及目前研究報(bào)道［8-10］中，我們認(rèn)為試驗(yàn)中迷迭香酸良好的抗輻射效果與其出眾的抗氧化能力相關(guān)。

圖5 RA 保護(hù)輻射損傷小鼠造血功能的倒“U”形劑量-效應(yīng)曲線Fig.5 The inverse U-shaped dose-response curve of RA for its protective effect on hematopoietic function of radiationinjured mice

試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸100 mg/kg 防護(hù)作用最為突出，與陽(yáng)性對(duì)照組效果相當(dāng)，在CFU-S 指標(biāo)上甚至好于陽(yáng)性藥物。而且對(duì)于大多數(shù)檢測(cè)指標(biāo)，迷迭香酸對(duì)輻射損傷小鼠的保護(hù)作用在50～200 mg/kg 范圍內(nèi)并不成預(yù)期的劑量依賴(lài)性，而是如圖4 所示呈倒“U”字形，防護(hù)效果RA 100 ＞50 ≧150＞200 mg/kg，即在100 mg/kg 時(shí)出現(xiàn)最高點(diǎn)，之后便開(kāi)始下降。此與2005 年P(guān)ereira 等在研究迷迭香酸抗焦慮作用時(shí)發(fā)現(xiàn)的情況相同，出現(xiàn)了如圖5 的倒“U”形劑量反應(yīng)曲線［11，12］。我們認(rèn)為這可能是由于機(jī)體不同系統(tǒng)對(duì)藥物劑量敏感閾值不同造成的［11］。有關(guān)迷迭香酸抗輻射作用的進(jìn)一步研究仍在進(jìn)行中。

1 Sanchez-Campillo M，Gabaldon JA，Castillo J，et al. Rosmarinic acid，a photo-protective agent against UV and other ionizing radiations.Food Chem Toxicol，2009，47:386-392.

2 Wang SW(王淑偉)，Liu XL(柳曉蘭)，Yu ZY(余祖胤)，et al.Protective effect of rosmarinic acid on γ ray-induced micronucleus in polychromatic erythrocytes of murine bone marrow cells.J Int Pharm Res (國(guó)際藥學(xué)研究雜志)，2011，38:381-384.

3 Landauer MR，Davis HD，Dominitz JA，et al. Dose and time relationships on the radioprotector WR-2721 on locomotor activity in mice.Pharm Biochem Behav，1987，27:573-576.

4 Landauer MR，Davis HD，Dominitz JA，et al. Long-term effects of radioprotector WR-2721 on locomotor activity and body weight of mice following exprosure to ionizing radition.Toxicol，1988，49:315-323.

5 Glover D，Retiley L，Carmichael Kim，et al. Hypocalcemia and inhibition of parathyroid hormone secretion after administration of WR-2721 (a radioprotective and chemoprotective agent).N Engl J Med，1983，309:1137-1141.

6 Ahn SC，Oh WK，Kim BY，et al.Inhibitory effects of rosmarinic acid on Lck SH2 domain binding to a synthetic phosphopeptide.Planta Med，2003，69:642-646.

7 Lee JS，Jung ES，Koh J，et al. Effect of rosmarinic acid on atopic dermatitis.J Dermatol，2008，35:768-771.

8 Chen SZ，F(xiàn)u YP，Wu RS，et al.Effects of rosmarinic acid on free radical production and lysosomal enzyme release from rat peritoneal neutrophils.Acta Pharm Sin，1999，34:881-885.

9 Kosar M，Goger F，Can Baser KH，et al. In vitro antioxidant propertries and phenolic composition of Salvia virgata Jacq.from Turkey.J Agric Food Chem，2008，56:2369-2374.

10 Del Bano MJ，Castillo J，Benavente-Garcia O，et al.Radioprotective antimutagenic effects of rosemary phenolics against chromosomal damage induced in human lymphocytes by γrays.J Agric Food Chem，2006，54:2064-2068.

11 Pereira P，Tysca D，Oliveira P，et al. Neurobehavioral and gentoxic aspects of rosmarinic acid. Pharm Res，2005，52:199-203.

12 Takeda H，Tsuji M，Inazu M，et al.Rosmarinic acid and caffeic acid produce antidepressive-like effect in the forced swimming test in mice. Eur J Pharmacol，2002，164:233-235.