硇洲馬尾藻(S.naozhouense)褐藻多酚的抗凝血活性研究

盧虹玉，陳曉敏，歐小蕾，毛俊杰，吉宏武

廣東海洋大學水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，湛江 524088

硇洲馬尾藻(S.naozhouense)屬褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬(Sargassum)海洋大型藻類［1］，俗稱黑菜，廣泛分布于湛江硇洲島海域且已經開始人工養殖［2］。因其具有清火、解喉毒和利尿等功效，當地漁民每年都大量采集食用，有很高的食用和藥用價值。但目前關于硇洲馬尾藻的研究與開發利用報道較少見，僅有少量報道對其基本營養成分和多糖進行了研究［3，4］，對其他生物活性成分研究未見報道。

海藻多酚是海藻中多酚類化合物的總稱，因具有獨特的生理活性，近年來成為研究熱點。其中褐藻中存在一類間苯三酚類單寧物質，被稱為褐藻多酚(Phlorotannins，PTs)，為間苯三酚衍生物，結構復雜多樣。大量研究表明，PTs具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗菌、抗凝血等等多種生物活性［5］。本研究擬從硇洲馬尾藻中提取PTs，進行體內和體外的抗凝血活性研究，為開發新型抗凝血或抗血栓藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料試劑

真空冷凍干燥機(東京理化)，旋轉蒸發儀(東京理化)，高速冷凍離心機(日本日立)，UV-2550紫外分光光度計(日本島津)，數顯恒溫水浴鍋(東京理化)，回旋流/切向流超濾器(德國賽多利斯)，蠕動泵(美國BARNANT)，微量移液器(美國吉爾森)。

硇洲馬尾藻全藻體由廣東海洋大學水產學院謝恩義教授鑒定和提供，采集于湛江徐聞。清水洗去表面泥沙及附生物，風干后粉碎待用。

昆明小鼠，6～8周齡，雄性;成年新西蘭兔。均由廣東醫學院SPF級動物中心提供。

Folin-酚試劑(北京鼎國生物技術有限公司);沒食子酸(Gallic acid，GA)(中國藥品生物制品檢定所);阿司匹林(拜耳醫藥保健有限公司);凝血酶原時間試劑盒;凝血酶時間試劑盒(南京建成生物工程研究所);其它試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 褐藻多酚提取

海藻干粉按1∶10(質量體積比)加入80%甲醇水溶液，室溫下避光振蕩16 h，過濾后殘渣重復浸提2次，合并上清夜，35℃避光真空旋轉蒸發濃縮去甲醇，水溶液以等倍體積乙醚和氯仿分別萃取2次，取水相，超濾(截留分子10K)，得水層內液NW1(＞10K高分子量)和水層外液NW2(＜10K低分子量)，真空冷凍干燥至粉末，-20℃保存。

1.2.2 總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法［6］測定多酚含量。上述提取物分別配制成一定濃度。在10 mL容量瓶中加入1 mL待測液、2 mL 1 mol/L的福林酚試劑乙，搖勻后靜置2 min，緩慢加入6 mL 12%Na2CO3，定容至10 mL，迅速搖勻，室溫放置1 h，765 nm處測定吸光度。以GA為標準品，制作標準曲線，得回歸方程:Y=0.1467X+0.0048，R2=0.9995，根據標準曲線計算總酚含量。

1.2.3 體內抗凝血活性

1.2.3.1 凝血時間(coagulation time，CT)測定(毛細管法)［7］

健康雄性昆明小鼠80只，隨機分成8組，每組10只小鼠，分別為:NW1中、高、低濃度各1組，NW2中、高、低濃度各1組，生理鹽水組和阿司匹林對照組。每天固定時間給藥，NW1和NW2中高低給藥劑量分別為 10、20、40 mg/kg.d，阿司匹林 20 mg/kg.d。連續灌胃給藥7 d后，于末次灌胃給藥1 h后將毛細管(內徑1.0 mm，長120 mm)插入小鼠眼內眥眼球后靜脈叢，自血液流入開始計時，注滿后取出平放于桌面，每隔5 s折斷毛細管兩端約0.5 cm，并緩慢向左右拉開，直至凝血絲出現為止，所經歷的時間即為凝血時間CT。

1.2.3.2 出血時間(bleeding tim，BT)測定(剪尾法)［7］

動物實驗分組及給藥同上2.3.1，于末次灌胃給藥30 min后，以酒精摩擦小鼠尾部至血管擴張，以剪刀在距離小鼠尾尖0.3 cm處剪斷，立即計時，每隔20 s用濾紙吸取血滴1次，直至血流停止(以濾紙吸至無血跡時為準)，記錄出血時間BT。

1.2.4 體外抗凝血活性

1.2.4.1 血漿凝血酶原時間(prothrombin time，PT)測定［8］

新西蘭兔正常喂養。實驗前按新鮮靜脈血與0.109 M 檸檬酸鈉體積比為9∶1，預先加入0.109 M檸檬酸鈉溶液。選取兔子靜脈較粗較清晰的耳朵，修剪采血部位的毛，用酒精多次擦洗，消毒，并使血管擴張充血。用刀片在血管上切一小口，讓血液自然流至預先裝有檸檬酸鈉管中，輕緩混勻，3000 rpm低溫離心15 min，收集上層液體，即為待測血漿，2 h內進行實驗。取待測血漿0.1 mL，分別加入0.05 mL 濃度為 1.0、5.0、10.0、15.0 mg/mL 的 NW1 和NW2，空白對照組加0.05 mL蒸餾水，陽性對照組加0.05 mL 1.0 mg/mL的阿司匹林，然后根據試劑盒說明進行操作，記錄凝固時間，即為PT值。每組平行測定10次。

1.2.4.2 血漿凝血酶時間(thrombin time，TT)測定［8］

血漿制備方法和實驗組組別設置及濃度設置同2.4.1，然后根據試劑盒說明進行操作，記錄凝固時間，即為TT值。每組平行測定10次。

1.2.5 數據統計與分析

應用SPSS、EXECL進行統計學處理，數據均以“平均值±標準偏差”表示，組間用t檢驗與LSD檢驗。

2 結果與分析

2.1 總酚含量測定結果

測定結果表明(表1)，NW1和NW2的總酚含量相近，以提取物干粉計分別為2.4和2.2 mg GA/g，以海藻干基計分別為0.324 mg GA/g，以干粉質量計提取率分別為13.51%和14.06%。

表1 總酚含量測定結果Table 1 Total phenolic content of extractive from S.naozhouense

2.2 體內抗凝血活性

2.2.1 硇洲馬尾藻褐藻多酚對CT的影響

表2數據顯示，與生理鹽水組相比，不同劑量NW1和NW2組的CT均有不同程度的延長，且差異性顯著。其中 NW1中劑量(20.0 mg/kg.d)對 CT的作用最顯著，為133.47 s，比生理鹽水組延長了84.78%，隨著劑量的增加，CT有所下降，說明NW1對CT的作用存在一個最佳劑量，濃度太高反而效果降低，這與魏玉西等［9］報道的鼠尾藻多酚的抗凝血作用相似。NW2高劑量組的CT相對較長。總的來說，低中高劑量的NW2對CT的作用沒有呈現出劑量與效果的明顯規律。

2.2.2 硇洲馬尾藻褐藻多酚對BT的影響

BT測定結果表明(表2)，與生理鹽水組對比，NW1組中高低劑量均能顯著延長BT，其中低劑量和高劑量的延長效果優于中劑量，最多延長了82.96%;NW2組不同劑量對BT的延長作用極為顯著，均延長了一倍以上，高劑量比生理鹽水組延長近1.6倍，比阿司匹林組延長了1.1倍。總體來說，NW2對BT的作用強于NW1。

表2 硇洲馬尾藻多酚對CT和BT的影響(n=10)Table 2 Effects of phlorotannins from S.naozhouense on CT and BT(n=10)

2.3 體外抗凝血活性

2.3.1 硇洲馬尾藻褐藻多酚對PT的影響

表中數據顯示(表3)，NW1能顯著延長PT，并表現出劑量時間依賴關系，當濃度為15 mg/mL時，PT為21.24 s，比對照延長了63.38%，顯著高于阿司匹林組;NW2在低濃度時表現出較低的PT延長活性，和生理鹽水組相比，沒有顯著性差異，隨著濃度的增加，NW2反而表現出顯著的縮短PT作用。

表3 硇洲馬尾藻多酚對PT和TT的影響(n=10)Table 3 Effects of phlorotannins from S.naozhouense on PT and TT(n=10)

2.3.2 硇洲馬尾藻褐藻多酚對TT的影響

從表3可看出，NW1對TT的延長作用極為顯著，并呈現劑量依賴關系，隨著濃度的增加，15 mg/mL的濃度組比生理鹽水組延長了近4倍(生理鹽水組的TT值在正常參考值范圍內)，遠高于阿司匹林組。NW2在低濃度時，有一定的劑量依賴關系，隨著濃度的增加，TT不再增加，5.0～15 mg/mL范圍內NW2對TT的作用沒有顯著差異性。對比NW1和NW2對TT的效果可以看出，NW1的作用更加顯著，這一點與兩者對PT的作用相似。表中數據還說明，陰性對照組的 PT(13.00±1.26s)和TT(14.00±0.85 s)測定結果分別在正常參考值10.7-14.3s和10.0 ～18.0 s范圍內，說明新鮮血漿的制備符合試劑盒的測定要求。

3 討論

褐藻多酚是海藻中一類重要的次生代謝產物，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、降血脂等多種活性。本研究通過體內和體外實驗對硇洲馬尾藻褐藻多酚的抗凝血作用進行了初步探討。

凝血過程是一種復雜的模式，包括內源性凝血途徑和外源性凝血途徑，兩者之間可以相互活化，并最終匯總于凝血酶形成和纖維蛋白形成的共同途徑。不同的抗凝血藥物作用的途徑不同，表現出的相應機制也不同。體內實驗結果表明，硇洲馬尾藻褐藻多酚NW1和NW2對CT和BT均有顯著延長作用，但兩者的作用不同，分子量相對大的NW1對CT的效果優于分子量相對小的NW2，魏玉西等［9］報道的結果與此類似。NW2對BT的延長效果顯著高于NW1。由于CT是內源性凝血途徑因子，而BT更多受血小板和毛細血管的影響，受凝血因子的影響相對較少，NW2主要為小分子量提取物，其中所含的成分相對更為復雜。因此，NW1和NW2產生的作用效果不同是正常現象。本實驗中采用的阿司匹林劑量與魏玉西等和丁麗等的研究一致［9，10］，但對CT的延長效果不顯著，他們的研究結果表明20 mg/kg.d的阿司匹林給藥劑量對小鼠具有顯著延長CT作用，可能與所使用的阿司匹林生產廠家不同有關，也有相關報道采用100 mg/kg.d高劑量的阿司匹林作為陽性對照。體外實驗檢測了硇洲馬尾藻褐藻多酚對PT和TT的作用，其中PT反映的是外源性凝血途徑，TT反映的是共同凝血途徑。

從以上結果可以看出，NW1對分別代表內源和外源的CT和PT均有顯著延長作用，對BT和代表共同途徑的TT也有顯著延長作用，是比較全面的抗凝血物質，而NW2對外源凝血途徑(PT)不起作用甚至起相反作用，對內源性凝血途徑(CT)和共同途徑(TT)有一定作用，對BT作用顯著。推測相對分子量較大的NW1的抗凝血作用可能更多的與凝血途徑因子相關。如抗凝血藥物肝素也有類似的現象，肝素的抗凝血因子IIa活性與其分子量有關，分子量在5400D以上才具有抗IIa活性［11］，并隨分子量增加活性升高;NW2可能更多的作用于其他方面。兩者的具體作用機制有待進一步研究。

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