應用ADx-ARMS法對大腸癌組織中K- ras 基因突變的檢測

高 穎 昌 紅 沈 兵 石 峰 張建英

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院病理科，北京 100038

大腸癌是我國最常見的消化道腫瘤惡性腫瘤，近年來隨工業化和城市化程度的增高、 居民飲食結構的改變，發病率逐年上升。 2011 年4 月在全國第17 個腫瘤防治周時發布的最新數據表明，北京、上海等大城市大腸癌年發病率接近40/10 萬，成為僅次于肺癌的第二位高發惡性腫瘤，是北京市發病率上升最快的惡性腫瘤之一。

近年來隨著分子生物學的研究進展，越來越多的研究表明基因突變是腫瘤發生的重要因素。大腸癌的發生與多種信號轉導通路系統的功能異常相關，其中Ras/MAPK 是誘發細胞核內反應的重要轉導通路。位于表皮生長因子受體（EGFR）下游的K-ras 基因在大腸癌中被認為是啟動腫瘤癌變的關鍵基因之一。 K-ras 基因位于12 號染色體，是Ras 基因家族成員之一，是一種原癌基因，長約35 kb，編碼K-ras 蛋白。 研究表明，其與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴散以及血管生成均有密切關系。 K-ras 被公認為可用于臨床實踐的大腸癌有效標志物[1-2]。

既往，針對大腸癌的各種治療方案選擇中主要依據是患者的性別、年齡、體重等因素來確定，千人一藥一量的用藥原則，導致了患者往往從中獲得不同的療效，既有患者從中受益，又有無效的治療案例，因此個體化治療逐步受到重視。 個體化治療的前提是治療靶點的檢測。 一項涉及9 個國家及地區、千人以上規模的研究顯示，沒有進行靶標檢測而進行靶向治療，其死亡風險將增加。 因此靶點檢測已經成為靶向藥物使用前必須檢測的項目。2009 年NCCN指南中明確指出大腸癌在使用相關靶向藥物之前必須進行K-ras 基因突變的檢測。 但目前我國國內K-ras 基因檢測方法相差很遠，檢測的敏感性、特異性差異巨大，應用分子水平的在大腸癌中的突變尚無大規模的數據。本研究以大腸癌患者作為研究對象，應用ADx-ARMS 方法，從分子水平檢測K-ras 基因突變的狀況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院2012 年4月～8 月的大腸癌標本40 例。 其中男26 例，女14 例；年齡32～86 歲，中位年齡63.5 歲；＜60 歲者17 例，≥60 歲者23例；高分化腺癌5 例，中-低分化腺癌29 例，黏液腺癌6 例；所有病例均經術前或術后病理切片確診，術前未接受放化療。

1.2 試劑與方法

1.2.1 檢測區域的選擇 比照蘇木精-伊紅染色（HE）在顯微鏡下標記腫瘤區域， 切片過程中僅選取相關腫瘤區域，避免選擇出血及壞死較多的區域。切取5 μm 蠟膜10 張于潔凈的環氧樹脂（EP）管中，嚴格做到每一個病例應用一個新的切片，并應用乙醇進行相關器具的消毒處理。

1.2.2 石蠟組織脫蠟處理 加入1 mL 組織脫蠟劑，Vertex混勻后靜置1 min，12 000 r/min 離心1 min 后棄上清，重復2 次。 加入無水乙醇1 mL 混勻后靜置1 min，12 000 r/min離心1 min 后棄上清，重復2 次。 將EP 管打開，至于37℃的溫箱中20 min，使乙醇充分揮發。

1.2.3 樣本DNA 提取 待組織中乙醇揮發干凈后，應用Qi-Aamp DNA FFPE Tissue Kit 試劑盒（Qiagen 公司生產），對樣本進行DNA 提取（方法參照試劑盒說明）。

1.2.4 樣本DNA 質量檢測 DNA 提取后應用紫外分光光度計測量DNA 質量及濃度。按照測量的DNA 濃度稀釋至2～5 mg/L 備用。

1.2.5 實時熒光PCR 檢測 應用廈門艾德公司生產的ADx-ARMS-k-ras 檢測試劑盒，對K-ras 基因2 號外顯子12、13密 碼 子 的7 個 突 變 熱 點（Gly12Asp、Gly12Ala、Gly12Val、Gly12Ser、Gly12Arg、Gly12Cys 及Gly13Asp）進行檢測。

1.3 統計學方法

采用統計軟件SAS 8.0 對數據進行分析， 計數資料以率表示，采用χ2檢驗。 以P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 K-ras 基因突變檢測結果

40 例大腸癌樣本中共發現K-ras 基因突變14 例，突變率約為35.0%，共檢測到5 種突變類型，其中1 例為雙突變。 12 密碼子突變9 例，13 密碼子突變5 例。 見表1。

表1 K-ras 基因突變檢測結果（n = 40）

2.1 患者臨床、病理特征與K-ras 基因突變狀態關系

K-ras 基因突變與年齡及組織學分型無關（P > 0.05），與患者性別（P < 0.05）及腺癌分化程度（P < 0.01）有關。 見表2。

3 討論

由于大腸癌早期是沒有任何癥狀的，當患者出現了膿血便、腸梗阻進行性貧血而去就診時，病變多已進展至中晚期，臨床分期較晚，從而喪失了許多治療機會。 每年約有四分之一新診斷的大腸癌患者伴有遠處轉移，40%～50%的初診無轉移患者在診斷治療后也會出現遠處轉移。 晚期轉移性大腸癌患者，如果不進行治療，中位生存期僅為5～6個月。轉移性大腸癌五年生存率不足10%[3]。隨著人類基因組計劃的全面完成及后基因組時代的開啟，越來越多的腫瘤癌基因被發現。 對于大腸癌形成及發展的機制研究不斷深入，RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路與結直腸癌的發生、發展密切相關的理論逐步被廣大學者所接受和證實。 突變的Ras 基因可以持續激活RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK信號傳導通路。 而K-ras 基因恰恰是該通路的重要相關基因，其突變可導致細胞的異常增殖及永生化[4]。 K-ras 基因位于12p12.1， 編碼位于細胞膜內側的具有GTP 活性的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白，是EGFR 的下游分子，在膜受體腺苷環化酶信號轉導途徑中發揮主要作用[5]。 在大腸癌的靶向治療中，EGFR 抑制劑及抗EGFR 單抗能特異性抑制野生型K-ras 基因的大腸癌細胞生長。 而K-ras 突變型大腸癌患者未能獲益， 主要因為K-ras 基因突變后可導致Kras 蛋白不依賴上游信號而永久激活， 從而導致細胞永生化[6-7]。 因此，大腸癌K-ras 基因的突變狀態是決定靶向治療療效的關鍵指標[8]。K-ras 基因在大腸癌中發生突變的概率高于其他基因[9]，其在大腸癌中的突變率在歐美國家報道為30%～68%，國內報道為15%～35%[10]。

表2 患者臨床、病理特征與K-ras 基因突變狀態關系（n = 40）

本研究K-ras 突變率為35.0%，與相關檢測數據一致[10]，但本研究樣本量較小，可能存在抽樣誤差，進一步大樣本研究將有助于減少誤差。 本研究發現，K-ras 突變以12、13密碼子的Gly13Asp 及Gly12Val 突變為主， 這與相關文獻報道該試劑盒相關位點PCR 擴增效率高，靈敏度高，反應低限可以達到1 copy/μL 的檢測結果相一致[11]。 由于突變型K-ras 基因患者不能從針對EGFR 的靶向治療中獲益，因此，中國大腸癌患者靶向治療前常規檢測K-ras 基因具有重要意義。本研究提示，K-ras 基因突變與患者性別及腫瘤的分化程度有相關性，與既往一些研究結果一致[12]。未發現K-ras 基因突變與年齡及腫瘤的病理學類型存在相關性，但也有研究發現K-ras 突變與年齡及性別存在相關性[13]。國內大多數的相關研究采用的檢測手段差異較大，從檢測蛋白水平的免疫組織化學法到檢測分子水平的PCR 法，從傳統的直接測序法到焦磷酸測序， 從經典的PCR 法到Real-Time PCR 等， 不同方法對樣本的檢測靈敏度相差甚遠，檢測靈敏度1%～50%，因而產生了不同的檢測結果，得到了不同的統計數據和結論。

目前國內多采用Real-Time PCR 及測序法對臨床樣本進行K-ras 突變檢測。 測序法是國內大多數第三方檢驗機構所采用，該方法的優點是準確性較高，可以檢測已知及未知突變，是檢測的金標準，但由于該方法敏感性低，只有突變的腫瘤細胞大于50%方可檢測，同時該方法運行成本大、耗時，特別是對于臨床小穿刺活檢組織難以檢測，因而很難在醫院開展。PCR 法因其靈敏度高，速度快，特別是對于樣本量較少的珍惜樣本有較好的接測結果從而被廣大得醫院所采用，目前主要得檢測方法有普通PCR、熒光定量PCR、高分辨率溶解度曲線法、ARMS 法等等。

本研究使用的是經原國家食品藥品監督管理局（SFDA）批準應用于臨床體外診斷的ADx-ARMS-K-ras 檢測試劑盒。 該試劑盒采用稀有突變檢測技術，憑借特異性的環狀引物雙擴增技術富集擴增突變的DNA，同時結合使用雙環探針指示擴增產物， 提高了檢測的特異性和靈敏度，克服了傳統PCR，直接測序法等檢測過程中敏感度不高的缺點，將突變基因DNA 的含量下限降低到了1%。 可以有效地減少因標本中腫瘤細胞少，特別是由于穿刺活檢組織中突變腫瘤細胞稀少所導致的假陰性結果的產生。 但該方法也存在這只能檢測已知突變的缺點。 由于目前研究的檢測方法的不同及檢測數據量所限，我國K-ras 基因突變的狀態尚不明確。 但隨著測序技術的發展，特別是第二代測序（焦磷酸測序）技術的應用，將測序法的靈敏度提高到5%， 建議將ARMS 法與可以測定未知突變的測序法聯合使用，進一步進行多中心、大樣本研究有助于明確我國K-ras 基因突變與大腸癌的臨床、 病理分型及分級之間的相關性， 為21 世紀大腸癌量體裁衣的個體化用藥提供可靠的數據。

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