血管緊張素Ⅱ1 型受體自身抗體在原發性腎小球疾病患者血清中的表達及意義*

熊 京， 楊慧敏， 朱 峰， 梁 瑩， 劉建社， 張 春， 汪 洋

(華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院1腎內科，3心血管內科，4急診科，湖北 武漢430022;2湖北省中醫院心血管內科，湖北 武漢430061)

原發性腎小球疾病是中國人群中發病率占首位的腎臟疾病。雖其發病機制復雜且未完全闡明，但免疫介導的炎癥反應是公認不爭的研究方向。實驗及臨床研究均證實始發的免疫反應需引起炎癥反應，且炎癥反應持續存在和不斷放大，才能導致腎小球損傷及其臨床癥狀［1-2］。近年來先兆子癇的研究發現，子宮-胎盤血流灌注減少，缺血缺氧導致血管內皮損傷，而內皮細胞功能紊亂可觸發血管緊張素II 1型受體自身抗體(angiotensin Ⅱtype 1 receptor agonistic autoantibodies，AT1-AA)的產 生［3-4］。AT1-AA作用于AT1受體，上調各種炎癥介質的表達，又進一步加重缺血缺氧、血管內皮損傷和炎癥反應，導致更多的AT1-AA 生成，形成惡性循環，不斷地放大炎癥反應，加重炎性損傷［5-6］。至今為止，AT1-AA 已被報道參與了血管炎、先兆子癇、惡性高血壓和移植腎排斥反應等多種疾病的發病機制［3，7］。腎素-血管緊張素-醛固酮系統在腎小球疾病的發生及進展過程中發揮了重要的作用［8］，但AT1-AA 在腎小球疾病中的作用卻鮮為人知。因此我們對300 多例原發性腎小球患者進行了調查，探討AT1-AA 是否參與了腎小球疾病的發病機制，以及它與腎小球疾病的各臨床和病理分型之間的相關性。

材 料 和 方 法

1 研究對象

2009 年4 月～2010 年1 月期間于武漢協和醫院腎內科住院的原發性腎小球疾病患者326 例。入選標準:經臨床病史、家族史、實驗室檢查結合腎活檢病理學檢查，排除腎囊腫、泌尿系結石及繼發性腎小球疾病(如系統性紅斑狼瘡、糖尿病、高血壓、過敏性紫癜、乙型肝炎、惡性腫瘤、風濕性疾病等)，確診為原發性腎小球疾病，診斷明確。所有患者12 周內均未使用過血管緊張素轉換酶抑制劑(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)或血管緊張素受體II阻滯劑(angiotensin Ⅱreceptor blocker，ARB)類藥物。排除標準:惡性高血壓，定義為舒張壓(diastolic blood pressune，DBP)≥130 mmHg。

患者組的分組標準如下:(1)根據在過去的12周內是否曾口服和(或)靜脈注射過糖皮質激素類藥物、環磷酰胺、雷公藤、環孢霉素A、他克莫司、來氟米特、嗎替麥考酚酯、甲氨蝶呤等，分成有免疫抑制劑用藥史組(用藥組)和無免疫抑制劑用藥史組(未用藥組)。(2)根據有無高血壓分為高血壓組和非高血壓組。高血壓判定方式采用2000 年WHO/ISH 診斷標準:收縮壓(systolic blood pressure，SBP)≥140 mmHg 和(或)DBP≥90 mmHg 認定為患有高血壓;患者既往有高血壓史，目前正服用抗高血壓藥物，即使血壓已低于140/90 mmHg，仍列入高血壓組。(3)根據AT1受體自身抗體的檢測結果分為AT1-AA(+)組和AT1-AA(-)組。正常對照組197 例，來自本院體檢中心健康體檢者，胸部正側位片、心電圖、肝腎功能電解質、血糖血脂、心肌酶及血常規、尿常規等檢查均未見異常。

2 臨床和病理資料采集

詳細詢問病史:年齡、性別和既往史。測量血壓。檢測血、尿標本各項指標，包括:血清白蛋白(albumin，ALB)、血清球蛋白、血尿素氮、血清肌酐、血糖、血清膽固醇、血清甘油三酯、24 h 尿蛋白定量、血抗心磷脂抗體、尿N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N -acetyl-β-glucosaminidase，NAG)、尿視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein，RBP)、尿ALB、尿免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和尿補體3(complement 3，C3)等。B 超引導下行經皮腎穿刺活檢術，腎組織常規行蘇木精- 伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色、過碘酸- 希夫(periodic acid-Schiff，PAS)染色、過碘酸-六胺銀染色(periodic acid-silver metheramine，PASM)和Masson 三色染色，光鏡、免疫熒光及電鏡檢查。

3 ELISA 法檢測血清AT1-AA

AT1受體多肽合成:采用多肽自動合成儀(SHIMADZU PSSM-8)，用固相多肽合成法合成具有抗原決定簇的AT1受體細胞外第2 環多肽片段。多肽片段序列參照文獻［7］。高壓液相色譜分析合成肽的純度，純度在95%以上。ELISA 法檢測自身抗體:參照本院心內科實驗室建立的方法［7］，檢測AT1-AA。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件處理。計量資料以均數±標準差(mean ±SD)表示，正態分布的兩組樣本均數比較，方差齊者采用t 檢驗，不齊者采用t’檢驗;非正態分布的兩組樣本均數比較用非參數檢驗。計數資料以率表示，兩樣本率的比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 AT1-AA 在原發性腎小球疾病患者血清中的表達

原發性腎小球疾病患者組的AT1-AA 陽性率明顯高于正常對照組(P ＜0.01)，見表1。

表1 AT1-AA 在原發性腎小球疾病患者中的表達Table 1. Expression of AT1-AA in the patients with primary glomerulopathy

2 免疫抑制劑對AT1-AA 檢測結果的影響

考慮到免疫抑制劑能抑制機體的免疫反應過程，干擾體內抗體的生成，從而可能造成AT1-AA 檢測結果的假陰性，故將326 例原發性腎小球疾病患者分成用藥組和未用藥組后，比較兩組的AT1-AA 陽性率。如表2 所示，用藥組的AT1-AA 陽性率明顯低于未用藥組(P ＜0.05)，證實了免疫抑制劑的確會干擾AT1-AA 的檢測結果，故后面的分析研究僅在未用藥組患者中進行。

表2 免疫抑制劑對AT1-AA 檢測結果的影響Table 2. Effect of immunosuppressive agents (ISA)on AT1-AA detection

3 AT1-AA 在未使用免疫抑制劑的原發性腎小球疾病患者血清中的表達

未用藥患者組共計280 例，其中141 例為女性，139 例為男性，女性患者所占比例為50.36%;平均年齡(36.47 ±14.21)歲;非高血壓組143 例，高血壓組137 例。正常對照組共計197 例，其中60 例為女性，137 例為男性，女性患者所占比例為30.46%;平均年齡(47.79 ±12.43)歲;均無高血壓。未用藥患者組的AT1-AA 陽性率達38.21%，而正常對照組僅為9.64%，兩者有顯著差異(P ＜0.01)，見表3。

表3 AT1-AA 在未使用免疫抑制劑的原發性腎小球疾病患者中的表達Table 3. Expression of AT1-AA in primary glomerulopathy patients without immunosuppressive agents (ISA)

4 原發性腎小球疾病患者AT1-AA 的表達與高血壓發病率的關系

非高血壓組和高血壓組的AT1-AA 陽性率均顯著高于正常對照組(P ＜0.01);但非高血壓組和高血壓組之間AT1-AA 陽性率的差異無統計學意義(P ＞0.05)，提示在腎小球疾病患者中，AT1-AA 與高血壓的發生可能無明顯的相關性，見表4。

表4 高血壓對原發性腎小球疾病患者AT1-AA 陽性率的影響Table 4. Effect of hypertension (HT)on the positive rate of AT1-AA in the patients with primary glomerulopathy

5 AT1-AA 與原發性腎小球疾病各臨床/病理類型之間的關系

按照臨床診斷，我們將280 例未使用免疫抑制劑的原發性腎小球疾病患者分成4 組:急性腎小球腎炎(acute glomerulonephritis，AGN)組、隱匿型腎小球腎炎(latent glomerulonephritis，LGN)組、慢性腎小球腎炎(chronic glomerulonephritis，CGN)組和腎病綜合癥(nephrotic syndrome，NS)組。比較各組之間的AT1-AA 陽性率，結果AGN 陽性率(25%)較其它組稍低，但各組間差異均無統計學意義(P ＞0.05)，見表5。

表5 不同臨床類型的腎小球疾病患者AT1-AA 陽性率的比較Table 5. Comparison of the positive rate of AT1-AA in the glomerulopathy patients with different clinical patterns

280 例未用藥組患者中進行了腎活檢病理學檢查者共196 例，包括膜增生性腎小球腎炎(membrano-proliferative glomerulonephritis，MPGN)患者2 例、膜性腎病(membranous nephropathy，MN)患者12例、局灶節段性腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，FSGS)患者12 例、IgA 腎病(IgA nephropathy，IgAN)患者63 例和系膜增生性腎小球腎炎(mesangial proliferative glomerulonephritis，MsPGN)患者107 例。5 種病理類型之間AT1-AA 陽性率的差異均無統計學意義(P ＞0.05)，見表6。

表6 不同病理類型的腎小球疾病患者AT1-AA 陽性率的比較Table 6. Comparison of the positive rate of AT1-AA in the glomerulopathy patients with different pathological patterns

6 AT1-AA 與各臨床參數之間的關系

AT1-AA(+)組的患者年齡大于AT1-AA(-)組(P ＜0.05);AT1-AA(+)組女性患者所占比例高于AT1-AA(-)組(P ＜0.01);AT1-AA(+)組的血清球蛋白水平高于AT1-AA(-)組(P ＜0.01);其余各項臨床參數之間在兩組間的差異均無統計學意義(P ＞0.05)，見表7。

表7 AT1-AA 與各臨床參數的單因素分析Table 7. The univariate analysis of AT1-AA and different clinical parameters

將年齡、性別、SBP、DBP 及血清球蛋白進行logistic 回歸分析發現:性別和血清球蛋白與AT1-AA的相關度分別為1.946(95%CI 1.160 ～3.264)和1.087(95%CI 1.025 ～1.152)。年齡、SBP 和DBP 與AT1-AA 的相關性無統計學意義，見表8。

表8 AT1-AA 與各臨床參數的多因素logistic 回歸Table 8. The multivariate logistic regression analysis of AT1-AA and different clinical parameters

討 論

1999 年Wallukat 等［3］在先兆子癇患者血清中檢測到AT1-AA，隨后在惡性高血壓、移植腎排斥反應等患者血清中也相繼發現高表達的AT1-AA。AT1-AA 被認為是AT1受體的激動劑，與多器官的血管損傷有關系。本研究通過對300 多例原發性腎小球疾病患者的調查發現，患者血清中AT1-AA 的陽性率顯著高于正常人群(P ＜0.01)，提示AT1-AA 可能參與了原發性腎小球疾病的發病機制。另外，進一步分組發現，無論非高血壓組或高血壓組原發性腎小球疾病患者的AT1-AA 陽性率均明顯高于正常對照組(P ＜0. 01)，但非高血壓組和高血壓組患者之間AT1-AA 陽性率的差異并無統計學意義(P ＞0.05)，提示AT1-AA 的致腎小球疾病機制可能獨立于致高血壓因素之外。

目前已證實，AT1-AA 與ATl 受體結合后可通過以下幾個途徑激活炎癥反應:(1)影響細胞內多種轉錄因子的活性，上調參與炎癥反應和凝血過程的靶基因的表達，促使多種炎癥介質和細胞因子的合成和分泌［7］;(2)生成的多種炎癥介質如組織因子、纖溶酶原激活物抑制物1、活性氧等，進一步加重缺血缺氧、血管內皮損傷及炎癥反應，導致更多的AT1-AA 生成，形成惡性循環，不斷放大炎癥反應，加重炎性損傷［9-10］;(3)AT1-AA 與ATl 受體結合后，促進抗原遞呈細胞遞呈抗原、趨化因子的產生以及Th1 細胞產生細胞因子，放大局部炎癥反應［11-12］;(4)AT1-AA 具有不隨時間而失敏感的受體激動劑樣活性，導致炎癥反應持續存在和不斷放大。眾所周知，腎小球內持續存在和不斷放大的炎癥反應是原發性腎小球疾病發病機制中的關鍵環節。因此我們推測:高表達的AT1-AA 誘發的持續炎癥反應可能是原發性腎小球疾病的重要發病機制。另外，本研究顯示近期使用過免疫抑制劑的患者AT1-AA 陽性率明顯低于無用藥史的患者，提示免疫抑制劑能有效地抑制AT1-AA 的生成，減少AT1-AA 的致病作用，從而延緩病情的進展。

我們進一步分析了AT1-AA 與原發性腎小球疾病患者臨床參數和臨床病理分型之間的關系。既往研究發現，AT1-AA 與AT1受體結合后既可直接刺激血管平滑肌細胞胞質游離鈣水平增高、導致血管收縮以及刺激心肌細胞搏動頻率增加，也具有介導心血管重構的作用，從而參與惡性高血壓的病變過程［4，13］。在本研究中，我們將惡性高血壓患者排除后發現，非惡性高血壓組與正常血壓組之間的AT1-AA 陽性率無統計學差異(P ＞0. 05);且AT1-AA(+)組與AT1-AA(-)組的SBP 和DBP 進行比較，結果亦無統計學差異(P ＞0.05)，提示非惡性高血壓與AT1-AA 之間可能無明顯相關性。Fu 等［14］提出，在非惡性高血壓患者中可能存在某種因素，可以增強患者的免疫耐受性，從而負性調節免疫反應，而惡性高血壓中則不存在該因素。另外，單因素分析和logistic 回歸分析結果顯示:一般臨床參數和實驗室參數中，僅性別和血清球蛋白與AT1-AA 的水平具有相關性。AT1-AA(+)組中女性患者所占比例明顯高于AT1-AA(-)組;同期研究也發現狼瘡性腎炎患者AT1-AA 陽性比率較正常對照組也明顯增高［15］。眾所周知，女性自身免疫性疾病(包括狼瘡)的發病率要高于男性，對于自身免疫性疾病與性別差異之間關系的研究前景正越來越受到科學家們的青睞，兩性之間性激素的不同是產生這種差異的重要原因。AT1-AA 屬于補體結合性的IgG1和IgG3抗體［14］，我們的統計結果也證實AT1-AA(+)組的血清球蛋白水平高于AT1-AA(-)組(P ＜0.05)。

不管根據臨床或病理分類，各類型患者中均檢測出較高水平的AT1-AA 陽性率，且各組間AT1-AA陽性率的差異均無統計學意義(P ＞0. 05)。雖然MPGN 患者的AT1-AA 陽性率達100%，但由于其病例數僅為2 例，故二者之間的關系尚有待進一步的觀察。臨床分類方面，慢性腎小球腎炎AT1-AA 陽性率最高，急性腎小球腎炎陽性率最低，但差異未達統計學意義(P ＞0.05)。故無論從臨床還是病理方面進行分型，AT1-AA 似乎都不是某一類型的原發性腎小球疾病的特異性抗體。

總之，我們通過對大量原發性腎小球腎炎患者臨床和病理資料的統計學分析發現，AT1-AA 可能是參與原發性腎小球疾病發病機制的重要因素。該發現為腎小球疾病的防治研究提供了新的理論基礎。但目前仍存在很多疑問，如:AT1-AA 與慢性腎小球疾病之間到底誰是因，誰是果，還是互為因果?AT1-AA 致腎小球疾病的發病機制是什么?抑制AT1-AA的產生能夠預防和治療腎小球疾病嗎?這些問題的解答都需要進一步的實驗室和臨床研究。

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