地奧司明對腎缺血再灌注大鼠腎組織MPO 和中性粒細胞CD11b、CD54 及CD62L 水平的影響*

袁 銘， 肖 漓， 許曉光， 高 鈺， 錢葉勇， 石炳毅

(中國人民解放軍第309 醫院全軍器官移植研究所，北京100091)

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)引起的急性損傷腎組織中可發現明顯的中性粒細胞浸潤，同時伴有相關黏附分子如CD11b、CD54、CD62L 和P-選擇素等增加，它們在組織炎癥損傷過程中起著重要作用［1-2］。國內外研究證實地奧司明(diosmin，DOSM)具有抗炎癥反應作用，它可能通過降低一些內皮細胞黏附分子的表達，在血管內皮細胞水平抑制白細胞的激活、遷移與黏附，減少炎癥介質的釋放，減輕脂質過氧化損傷［3-5］;本實驗以SD 大鼠腎I/R模型為基礎，以DOSM 作為干預手段，測定腎臟組織中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和血中中性粒細胞CD11b、CD54 和CD62L 的表達水平的變化。

材 料 和 方 法

1 材料

同齡健康雄性SD 大鼠180 只，體重200 ～220 g(北京維通利華實驗動物技術有限公司，SCXK 京2007-0001)。DOSM 由南京正大天晴藥業股份有限公司饋贈。大鼠MPO ELISA 試劑盒為R＆D 產品。抗CD62L-FITC、抗CD11b-FITC 和抗CD54-PE 單克隆抗體均為ABGAb 產品。

2 方法

2.1 動物分組及I/R 模型制備［5］SD 大鼠隨機分為假手術(sham operation，SO)組、I/R 組和DOSM +I/R 組。3 組分別于術后1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和48 h 從下腔靜脈采血后處死10 只大鼠，全血置于-80 ℃冰箱保存以備檢測。取腎臟組織2.5 g，用磷酸鹽緩沖液5 mL 制成勻漿，離心后取上清液置于-80 ℃冰箱保存待測。

2.2 腎臟組織中MPO 的測定 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行定量測定。

2.3 流式細胞術檢測CD11b、CD54 和CD62L 在中性粒細胞表面的表達 在每個流式檢測管中加入50 μL 的熒光標記稀釋后的Ⅰ抗(抗體用緩沖液稀釋成合適的濃度);在空白管中加入50μL 緩沖液。每管分別加入100 μL 全血，并輕輕混勻。避光孵育15 ～30 min，進行直接免疫熒光染色。每管分別加入2 mL 紅細胞裂解液，混合均勻。室溫避光孵育10 min，異裂解紅細胞，此孵育時間不要超過15 min。室溫1 500 r/min，離心5 min，并棄去上清液。用2 mL 緩沖液洗滌細胞2 次。重懸細胞后上流式細胞儀分析。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean ±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析，使用SPSS 12.0 軟件包進行統計學分析。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 腎臟組織勻漿中MPO 活性的變化

SO 組腎組織勻漿中MPO 活性組內各時點比較無顯著差異;與SO 組相比，I/R 組MPO 活性在1 h、3 h 和6 h 各時點明顯升高，而在12 h 和24 h 開始下降，但仍高于同時點SO 組(P ＜0.01，48 h 組除外);DOSM+I/R 組MPO 活性也于1 h、3 h 和6 h 各時點明顯升高，且在6 h 左右達高峰，此后在12 h、24 h 和48 h 明顯降低，與 I/R 組相比差異顯著(P ＜0.05 或P ＜0.01)，與SO 組相比無顯著差異，見圖1。

Figure 1. Changes of MPO activity in rat kidney tissues from different groups. Mean±SD. n =10. ＊＊P ＜0.01 vs SO group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs I/R group.圖1 各組大鼠腎組織MPO 活性變化

2 不同時點大鼠血中性粒細胞CD11b、CD54 和CD62L 的表達

2.1 DOSM 對CD11b 的影響 結果見表1。CD11b在各組內自1 h 至6 h 均逐漸升高，并于6 h 達高峰，此后逐漸降低。在相同時點，I/R 組均顯著高于SO組，差異顯著(P ＜0.01)，各時點DOSM +I/R 組顯著低于I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。

2.2 DOSM 對CD54 的影響 結果見表2。CD11b在各組內自1 h 至24 h 均逐漸升高，并于24 h 達高峰，此后逐漸降低。在相同時點，I/R 組均顯著高于SO 組，差異有統計學意義(P ＜0.01)，各時點DOSM+ I/R 組顯著低于I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。各時點DOSM+ I/R 組與SO 組比較，除3 h 和24 h之外無顯著差別。

2.3 DOSM 對CD62L 的影響 結果見表3。CD62L在各組內自1 h 至3 h 升高，并于3 h 達高峰，此后逐漸降低。在相同時點，I/R 組均顯著高于SO 組，差異有統計學意義(P ＜0. 05 或P ＜0.01)，各時點DOSM + I/R 組顯著低于I/R 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)。自1 h 至12 h DOSM + I/R 組高于SO 組(P ＜0.05 或P ＜0.01)，此后2 組之間無顯著差異。

表1 不同時點大鼠血中性粒細胞表面CD11b 的表達Table 1. The expression of neutrophil adhesion molecule CD11b in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

表2 不同時點大鼠血中性粒細胞表面CD54 的表達Table 2. The expression of neutrophil adhesion molecule CD54 in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

表3 不同時點大鼠血中性粒細胞表面CD62L 的表達Table 3. The expression of neutrophil adhesion molecule CD62L in rat blood after kidney ischemia(%.Mean±SD.n=10)

討 論

腎臟I/R 損傷的發生發展是一個極其復雜的病理生理過程，其發病機制涉及中性粒細胞浸潤、氧化應激損傷、細胞凋亡等，并有眾多炎性介質和免疫因子的參與［6-7］。我們曾研究發現在腎I/R 病理過程中促炎癥細胞因子腫瘤壞死因子α、白細胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6 和IL-8 的產生顯著增加，而抗炎癥細胞因子IL-10 的產生卻減少［5］，同時腎組織的脂質過氧化反應顯著增強［4］。因此減少中性粒細胞對組織細胞的黏附及相關炎癥介質的釋放對減輕I/R 損傷具有一定的作用［1］。

MPO 主要存在于中性粒細胞的噬天青顆粒中，是中性粒細胞的特異性酶，能催化產生多種活性氧化物質，導致氧化應激和氧化性組織損傷，其激活程度與中性粒細胞的浸潤程度密切相關。CD54 又稱為細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)，是免疫球蛋白超家族的一員，是一組跨膜的單鏈糖蛋白，主要分布在白細胞、巨嗜細胞、血管內皮細胞等，是最重要的白細胞、內皮細胞間黏附分子之一。CD11b 是整合素家族中β2 亞族的一員，主要在中性粒細胞和單核細胞上表達，通過與內皮細胞表面的黏附分子如ICAM-1、E-選擇素結合而介導白細胞與內皮細胞間相互作用。CD11b 受體密度上調是炎癥反應的重要標志，可促進中性粒細胞和單核細胞黏附于內皮細胞、細胞外基質。CD62L 為L-選擇素，表達于大多數中性粒細胞、單核細胞和嗜酸粒細胞，它介導白細胞與內皮細胞最初的滯留和滾動，尤其重要的是CD62L 還介導白細胞遷移到炎癥部位，介導中性粒細胞相互之間的作用。

DOSM 是黃酮類化合物中的一種天然成分，在可食用植物、水果和蔬菜中，特別是在柑橘類水果的果皮中含量豐富，有增加靜脈張力、促進淋巴回流、降低毛細血管通透性及增加毛細血管阻力的作用。目前臨床上常將DOSM 單用或與橙皮苷復合作為血管保護藥和靜脈張力增強藥應用于慢性靜脈功能不全、靜脈潰瘍和急性痔瘡的治療［8］。DOSM 可通過降低一些內皮細胞黏附分子的表達，在毛細血管水平抑制白細胞的激活、遷移與黏附，減少炎癥介質的釋放，從而降低毛細血管的通透性。那么DOSM 是否具有抑制MPO 以及中性粒細胞表面CD11b、CD54及CD62L 等分子的表達而發揮抗炎作用?本實驗以大鼠腎臟I/R 為基礎，以DOSM 為干預治療措施，觀察到:(1)DOSM+I/R 組MPO 活性與I/R 組相比明顯下降，與SO 組相比無顯著差異，表明DOSM 可顯著降低缺血再灌注腎臟組織MPO 的活性，提示DOSM 減少了中性粒細胞的浸潤，從而發揮抗炎作用。(2)中性粒細胞CD11b、CD54 及CD62L 的表達在相同時點I/R 組顯著高于SO 組，而在DOSM 組則顯著低于I/R 組，說明DOSM 可顯著降低CD11b、CD54 及CD62L 的表達。

本研究顯示，腎I/R 后給予DOSM 治療可顯著減低MPO 活性，并顯著降低中性粒細胞表面CD11b、CD54 及CD62L 等的表達，從而減少中性粒細胞對組織細胞的黏附浸潤，抑制I/R 損傷的炎癥反應。

(致謝:南京正大天晴藥業股份有限公司提供資助!)

［1］ Kiris I，Tekin I，Yilmaz N，et al. Iloprost downregulates expression of adhesion molecules and reduces renal injury induced by abdominal aortic ischemia-reperfusion［J］.Ann Vasc Surg，2009，23(2):212-223.

［2］ de Rossi LW，Horn NA，Buhre W，et al. The effect of isoflurane on neutrophil selectin and β2-integrin activation in vitro［J］. Anesth Analg，2002，95(3):583-587.

［3］ Korthui RJ，Gute DC. Anti-inflammatory actions of a micronized，purified flavonoid fraction in ischemia/reperfusion［J］. Adv Exp Med Biol，2002，505:181-190.

［4］ 袁 銘，錢葉勇，韓 勇，等. 地奧司明對腎缺血/再灌注大鼠氧化應激及腎功能的影響［J］. 軍醫進修學院學報，2012，33(11):1171-1173.

［5］ 袁 銘，石炳毅，錢葉勇. 地奧司明對腎缺血/再灌注大鼠血清和腎組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-10水平的影響［J］. 中國病理生理雜志，2012，28(6):1066-1070.

［6］ Furuichi K，Wada T，Kaneko S，et al. Roles of chemokines in renal ischemia/reperfusion injury［J］. Front Biosci，2008，13:4021-4028.

［7］ 徐夏蓮，蔣素華，許迅輝，等. 晚期缺血預適應促進低氧誘導因子的表達，減輕腎臟缺血再灌注損傷［J］. 中國病理生理雜志，2011，27(2):320-325.

［8］ 黎鳳明，田曉東，胡國文，等. 地奧司明的臨床應用進展［J］. 現代中西醫結合雜志，2012，21(6):680-681.