維生素C 對CD4 + 效應(yīng)記憶性T 細(xì)胞體外擴增的影響*

張譯文， 羅海華， 張 旭， 張 輝， 劉 超

(中山大學(xué)人類病毒學(xué)研究所，熱帶病防治研究教育部重點實驗室，廣東 廣州510080)

人類免疫缺陷病毒1 型(human immunodeficiency virus 1，HIV-1)感染導(dǎo)致的艾滋病療法(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是本世紀(jì)威脅人類健康的重大傳染病。目前，國際上多采用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy，HAART)治療艾滋病。HAART 可在短期內(nèi)將病毒載量控制在較低的水平，改善艾滋病患者的生存質(zhì)量，但不能完全清除體內(nèi)病毒，需終身服藥，且HAART費用昂貴，有嚴(yán)重的副作用，易耐藥［1］。隨著我國HIV-1 感染人數(shù)的日益增加，亟待研發(fā)新的行之有效的抗病毒治療方法。

近年來，利用免疫細(xì)胞過繼治療的方法成為了HIV-1 臨床治療的一大熱點。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)特異性T 淋巴細(xì)胞對艾滋病患者的病毒清除和免疫重建療效顯著［2］。人體內(nèi)的特異性T 淋巴細(xì)胞分為CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞。CD4+T 細(xì)胞通過提呈抗原并介導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫。T 淋巴細(xì)胞分為3 個亞群，初始T 淋巴細(xì)胞、效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞及記憶性T 淋巴細(xì)胞［3］。而記憶性T 細(xì)胞則又可以根據(jù)是否具有快速的效應(yīng)功能和表達相應(yīng)的歸巢受體C-C 趨化因子受體7(C-C chemokine receptor 7，CCR7)和L-選擇素(L-selectin，CD62L)劃分為2 個功能亞群:中央記憶性(central memory T cells，TCM)和效應(yīng)記憶性T 細(xì)胞(effector memory T cells，TEM)［4-7］。在HIV-1 病毒感染過程中，雖然記憶性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在清除HIV-1 病毒方面發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，但是TEM 在病毒控制上效果更為顯著［8］。由于TEM 細(xì)胞在T 細(xì)胞的總數(shù)中占的比例非常小，用傳統(tǒng)的體外擴增方法難以獲得。維生素C(vitamin C，VC)作為一種小分子藥物，最早在臨床上用于壞血病的治療，其抗氧化作用被廣泛應(yīng)用。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，VC 在抑制腫瘤生長［9-10］上發(fā)揮了一定的作用，并且可高效地維持干細(xì)胞的存活和自我更新［11-12］。為了在體外獲得大量的CD4+TEM，提高過繼免疫治療的效果，本研究首次利用VC 在體外成功地促進了CD4+TEM 的大量擴增。

材 料 和 方 法

1 材料

人的外周成分血由廣州市血液中心提供，隨機選取了10 份健康人的血液。主要試劑:RPMI-1640培養(yǎng)基購于Invitrogen;胎牛血清購于Gibco;VC 購于Sigma;淋巴細(xì)胞分離液購于天津灝陽生物制品有限責(zé)任公司;流式細(xì)胞儀檢測抗體anti-CD4-PE、anti-CD27-FITC、anti-CCR7-PECY5 和5，6-羧基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺脂(5，6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)購于BD;anti-CD45RAECD 購于Beckman;CD4+T 細(xì)胞陰性選擇磁珠購于BD;CellTiter 96 AQueous One Solution 試劑盒購自Promega。

2 儀器

倒置生物顯微鏡(Leica)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)、臺式高速離心機(Eppendorf Centrifuge 5810R)、生物安全柜(Thermo Scientific)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)和磁珠分選磁力架(BD Pharmigen)。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞分離 將外周成分血與PBS(含2% BSA和0.5% EDTA)按1∶4 混合均勻;然后將稀釋后的成分血液以1∶1 比例緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液的上方;1 450 r/min 離心45 min;小心吸取單核細(xì)胞，加入另一離心管中，用5 倍體積的PBS(含0.5% BSA和2% EDTA)稀釋，混合均勻后，300 × g 離心15 min;重復(fù)上一步驟1 次;孵育CD4+T 細(xì)胞陰選試劑I 抗，15 min;用10 倍體積的PBS(含0.5% BSA 和2% EDTA)稀釋，300 ×g 離心15 min;磁珠II 抗孵育，30 min;進行過柱細(xì)胞分選，得到CD4+T 細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 重懸細(xì)胞，計數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞至所需濃度。

3.2 培養(yǎng)條件 將5 ×106cells/well CD4+T 細(xì)胞置于1 mL 含10%胎牛血清的RPMI-1640 中培養(yǎng)。在5% CO2、飽和濕度及37 ℃下進行。

3.3 添加VC 及細(xì)胞因子 將分離好的CD4+T 細(xì)胞進行計數(shù)并分為2 組;每組均以5 ×106cells /well鋪于12 孔板中，每孔加入anti-CD3、anti-CD28、IL-7和IL-15;在實驗組的每孔細(xì)胞中額外加入不同濃度的VC(50 mg/L、75 mg/L、100 mg/L 和125 mg/L)。

3.4 細(xì)胞亞群分析及細(xì)胞數(shù)量的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)第0 天、10 天和15 天，吸取培養(yǎng)孔中的細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)儀進行計數(shù);再將細(xì)胞，300 ×g 離心15 min，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，孵育檢測CD4+TEM 的流式抗體(CD45RA、CD27 和CCR7)30 min;加入5 倍體積的PBS 稀釋，300 ×g 離心10 min 洗掉流式抗體，加入PBS 重懸至需要的細(xì)胞密度，使用流式細(xì)胞儀進行檢測。對照組與實驗組均為同一供體的CD4+T細(xì)胞。從CD4 陽性(F 區(qū)域)和CD45RA 陰性(L 區(qū)域)的細(xì)胞中選取CD27 與CCR7 雙陰性的細(xì)胞(J3區(qū)域)，即為所要觀察的CD4+TEM，見圖1。

3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖 從分選得到的不同供體的CD4+T 細(xì)胞中吸取細(xì)胞5 ×105個，300 ×g 離心15 min，用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，孵育檢測增殖的流式抗體CFSE 30 min，細(xì)胞嚴(yán)格避光培養(yǎng)5 d，加入PBS 洗滌細(xì)胞2 次，稀釋到使用濃度，運用流式細(xì)胞術(shù)檢測。對照組與實驗組均為同一供體來源的CD4+T 細(xì)胞。

Figure 1. Detection of CD4 + TEM by flow cytometry. A:prepared cells were gated with E region;B:prepared cells were stained for CD4 and regated with F region from E region to get CD4-positive cells;C:prepared cells were staining for CD45RA and regated with L region from E region to get CD45RA-negative cells;D:prepared cells were stained for CCR7 and CD27，and regated with J3 region from F and L regions to get CCR7 - CD27 - cells.圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4 + TEM

3.6 MTS 法測定細(xì)胞活性 將分離好的CD4+T 細(xì)胞進行計數(shù)并分為2 組;每組均以1 ×105cells /well鋪于96 孔板中，每孔加入anti-CD3、anti-CD28、IL-7和IL-15;在實驗組的每孔細(xì)胞中加入100 mg/L VC，培養(yǎng)15 d 之后，每孔加入20 μL MTS［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl )-5-(3-carboxymethoxyphenyl )-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt］溶液，在5%CO2、飽和濕度及37 ℃下孵育3 h 后測定490 nm 吸光度(absorbance，A)。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 分析軟件。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較使用t 檢驗或單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 VC 對于CD4+ T 細(xì)胞總數(shù)擴增效果的檢測

VC 處理第10 天對照組細(xì)胞數(shù)量為(9.29 ±0.81)×106;加50 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(9.43 ±0.41)×106;加75 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(9.13 ±0.76)×106;加100 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(9.21 ±0.15)×106;加125 mg/L VC 的細(xì)胞數(shù)量為(8.75 ±0.16)×106。對擴增結(jié)果進行CFSE 檢測，表示增殖的陽性峰在對照組和實驗組之間沒有差異。上述實驗結(jié)果均顯示，VC 對于CD4+T 細(xì)胞的總量擴增沒有顯著影響，見圖2。

Figure 2. Effect of VC on CD4 + T cell amplification.A:CD4 + T cells were treated with 500 μg/L anti-CD3，500 μg/L anti-CD28，1 mg/L IL-7 and 1 mg/L IL-15，and cultured for 10 days with different concentrations (50 mg/L，75 mg/L，100 mg/L and 125 mg/L)of VC. Cells were analyzed by cell counter. B:CD4 + T cells were stained with CFSE and subsequently activated and expanded with or without VC (50 mg/L)for 5 days.The mean CFSE fluorescence of CD4 + T cells was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=10.圖2 VC 對CD4 + T 細(xì)胞擴增的影響

2 VC 對CD4+ TEM 在CD4+ T 細(xì)胞中所占比例的影響

在CD4+T 細(xì)胞中，CD4+TEM 的比例隨著VC濃度的增加而逐漸增加。對照組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占13.10%;VC 50 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占17.9%;VC 75 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占27.6%;VC 100 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占38.6%;VC 125 mg/L 組CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中占30.1%。上述結(jié)果表明，VC 對于CD4+TEM 細(xì)胞的比例擴增作用在低于100 mg/L 的情況下存在劑量依賴的趨勢，并且100 mg/L 是促進TEM 細(xì)胞比例增加的最佳濃度，見圖3。

Figure 3. Effect of different concentrations of VC on the proportion of CD4 + TEM in CD4 + T cells.CD4 + T cells were cultured with indicated treatments for 10 days. Mean±SD.n=10.圖3 VC 對CD4 + TEM 細(xì)胞比例的影響

3 VC 對CD4+ TEM 數(shù)量的影響

100 mg/L VC 處理細(xì)胞后，第0 天，對照組和實驗組細(xì)胞數(shù)量為均1 ×105;第10 天，對照組細(xì)胞數(shù)量為(1.23 ±0.15)×106，實驗組細(xì)胞數(shù)量為(3.56±0.35)×106;第15 天，對照組細(xì)胞數(shù)量為(1.85 ±0.75)× 106，實驗組細(xì)胞數(shù)量為(5.47 ± 0.11)×106，見圖4。選取擴增效果達到最高點(第15 天)的2 組CD4+TEM 細(xì)胞數(shù)量進行比較，對照組為(1.85±0.75)×106，實驗組為(5.47 ±0.11)×106，2 組間細(xì)胞數(shù)量差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。

Figure 4. Effect of VC on CD4 + TEM number at different time points. Mean±SD.n=3. ＊＊P ＜0.01 vs control at the same time point.圖4 VC 對CD4 + TEM 數(shù)量的影響

4 VC 對細(xì)胞活性的影響

100 mg/L VC 處理細(xì)胞后，第15 天對照組的吸光度值為0.715 ±0.010，實驗組的吸光度值為0.676±0.010，兩組間沒有顯著差異，見圖5。

Figure 5. Effect of VC on CD4 + T cell viability. CD4 + T cells were treated with 100 mg/L VC. After 15 days of culture，the cell viability was tested by MTS assay.Mean±SD.n=3.圖5 VC 對細(xì)胞活性的影響

討 論

T 細(xì)胞的體外擴增一直是免疫過繼治療的一大熱點，目前一些研究者使用人工抗原來提呈細(xì)胞，在體外提高T 細(xì)胞的增殖并用于過繼治療，但是此技術(shù)成本高且尚無法保證臨床治療的安全性［13］。在本研究中，我們首次利用小分子藥物VC 促進CD4+TEM 細(xì)胞在體外的擴增。實驗組中，CD4+T 細(xì)胞的總數(shù)沒有明顯變化;但較之對照組，其CD4+TEM 細(xì)胞的比例在CD4+T 細(xì)胞中顯著升高;通過對CD4+TEM 數(shù)量的檢測，在實驗組中發(fā)現(xiàn)CD4+TEM 細(xì)胞數(shù)量顯著增多。

T 細(xì)胞的免疫過繼治療當(dāng)中，如果大量的過繼轉(zhuǎn)移T 細(xì)胞會產(chǎn)生過激反應(yīng)，在實驗過程中，我們找到了在T 細(xì)胞總數(shù)不變的情況下，將大量初始T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+TEM 細(xì)胞的方法。實驗中我們也進一步找出了VC 可促進CD4+TEM 在體外擴增的最適濃度:VC 100 mg/L。我們發(fā)現(xiàn)，使用較低劑量的VC處理細(xì)胞后，CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中的比例上升存在顯著的劑量依賴趨勢;而當(dāng)VC 的濃度達到125 mg/L 時，CD4+TEM 在CD4+T 細(xì)胞中的比例上升的效果卻開始明顯下降(圖3)，這可能是由于藥物濃度過大使得細(xì)胞的生長環(huán)境發(fā)生了較大改變從而影響了細(xì)胞的正常生長。本實驗選取VC 處理細(xì)胞10 d 以后進行計數(shù)和檢測是由于在外周血中CD4+TEM 的起始數(shù)量非常少，CD4+T 細(xì)胞需要較長的時間才能在anti-CD3 與anti-CD28 共同刺激下逐漸形成較多的CD4+TEM。實驗結(jié)果也表明選擇培養(yǎng)較長時間后進行檢測可獲得更好的效果(圖2、4)。同時，我們采用MTS 法對使用最佳擴增濃度100 mg/L 的VC 刺激細(xì)胞15 d 的細(xì)胞活性進行了檢測，對照組和實驗組在490 nm 處的吸光度值沒有顯著差異(圖5)。由此也證明，使用100 mg/L VC 在體外長時間擴增TEM 細(xì)胞不會使細(xì)胞活性受到損害。

VC 作為一種抗氧化劑，無毒副作用，易獲得，作為常用的小分子藥物具有較高的生物安全性，廣泛用于臨床醫(yī)療［14-15］。VC 對CD4+TEM 的體外擴增作用可作為新型的過繼免疫治療方式用于艾滋病的臨床治療當(dāng)中，其作用機制還有待進一步研究。

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