針刺對胚胎著床障礙大鼠CD4 + CD25 + Foxp3 +調節性T 細胞的影響*

高偉娜， 咼 月， 王麗君， 唐 瀟， 劉亞飛， 陳鎮燕， 張明敏， 黃光英

(華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院中西醫結合研究所，湖北 武漢430030)

CD4+CD25+調節性T 細胞(regulatory T-cells，Treg 細胞)是一類具有免疫抑制作用的T 細胞。這類細胞不僅參與自身免疫耐受的調節，而且在腫瘤免疫和移植免疫中有重要作用。近年來在正常妊娠婦女的外周血和蛻膜以及孕鼠的外周血、淋巴結、脾臟等組織均發現CD4+CD25+調節性T 細胞的存在，提示它們在母胎免疫耐受中有重要作用［1-4］。本課題組前期的研究已經證實了針刺能夠提高胚胎著床障礙大鼠的懷孕率和著床胚胎數［5］。那么，針刺的治療作用是否與CD4+CD25+調節性T 細胞的調節作用相關尚缺乏研究，本文旨在觀察針刺對胚胎著床障礙大鼠CD4+CD25+Foxp3(forkhead box P3)+調節性T 細胞的影響，以探討針刺提高胚胎著床障礙大鼠懷孕率的機制。

材 料 和 方 法

1 動物及分組

SPF 級成年未孕雌性Wistar 大鼠(10 ～12 周，平均體重為220 ～230 g)和有生育能力的成年雄性Wistar 大鼠(250 ～300 g)購于湖北省疾病控制中心，許可證號為SCXK(鄂)2008 -0005。所有大鼠均飼養于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心屏障系統。適應性喂養1 周后，所有雌性大鼠進行陰道涂片觀察動情周期，動情周期正常者納入本實驗。處于動情期的雌性大鼠與雄性大鼠以2∶1 的比例于每日下午6:00 進行交配，次日早上8:00 行大鼠陰道涂片，發現有大量精子者視為懷孕，當天記為妊娠第1 天。然后將妊娠大鼠隨機分為對照組(N)和米非司酮組(M)、米非司酮+針刺組(A)和米非司酮+黃體酮組(W)，每組36 只，每組孕鼠根據處死的時間隨機再分為6 d 組、8 d 組和10 d 組。

2 試劑與儀器

米非司酮片(夕韻，湖北葛店人福藥業)和黃體酮注射液(浙江仙琚藥業)由華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院提供。IV 型膠原酶和透明質酸酶購于Sigma。大鼠淋巴細胞分離液購于北京達科為公司。RPMI-1640 培養基來自中國賽默飛世爾生物科技有限公司。胎牛血清來自杭州四季青生物工程材料有限公司。FITC 標記的抗大鼠CD4 抗體、PE 標記的抗大鼠CD25 抗體、Alexa Fluor? 647 標記的抗大鼠Foxp3 抗體和Alexa Fluor? 647 小鼠IgG1κ 亞型對照抗體購于BioLegend。Foxp3 固定破膜試劑盒和抗大鼠多克隆抗體Foxp3 購于eBioscience。HRP(辣根過氧化物酶)標記的山羊抗大鼠IgG 和山羊或兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體購于Santa Cruz。RIPA裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒和超敏ECL 化學發光試劑盒購于碧云天生物科技研究所。Cocktail蛋白酶抑制劑購于Roche。硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜購自Pierce。引物、TRIzol RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和SYBR 熒光定量試劑盒購于TaKaRa。主要設備:DU730 核酸蛋白質分析儀(Beckman Coulter)，PCR 儀(Eppendorf Company)，熒光定量PCR 儀(Applied Biosystems)，全能酶標儀(BioTek)，流式細胞儀(BD Bioscience)。

3 造模與處理

在超凈工作臺中將米非司酮研磨成粉末后溶于適量體積的麻油中，配置成2 g/L 的米非司酮麻油溶液，分裝后置于4 ℃冰箱中備用。M 組、A 組和W 組孕鼠在妊娠第1 天上午9:00 于頭頸部皮下注射米非司酮麻油溶液(5.5 mg/kg)，N 組則給予同量的純麻油溶液。同時各組大鼠從妊娠第1 天直至處死當天予以治療或對照處理。每天下午固定時點A 組孕鼠用自制布袋給予固定，并針刺后三里和三陰交25 min，每5 min 行針1 次，穴位的定位和進針深度參考前期的研究［5］;M 組和N 組孕鼠僅固定不予針刺;W組孕鼠則每日肌肉注射黃體酮(40 mg/kg)。

4 取材

各組孕鼠在1%戊巴比妥鈉的麻醉下行剖腹，觀察胚胎著床情況，并記錄胚胎數。用肝素鋰抗凝管腹主動脈取血2 mL 置于4 ℃冰箱備用。2/3 子宮組織被收集，立即放入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中用于后續的流式檢測，剩余的子宮組織置于-80 ℃冰箱保存備用。

5 外周血和著床點子宮淋巴細胞的提取和調節性T 細胞的流式檢測

取肝素鋰抗凝的大鼠外周血1 mL，并用等體積的PBS 稀釋，緩慢加入2 mL 的淋巴細胞分離液之上，以2 000 ×g、22 ℃離心30 min。收集白色云霧狀的淋巴細胞層，PBS 充分洗滌，細胞重懸。

在解剖顯微鏡下，將收集的新鮮的子宮組織沿子宮系膜對側打開，分離出胎兒，收集著床點子宮內膜。收集的組織在PBS 中漂洗后，剪成體積為1 mm×1 mm ×1 mm 小塊組織，加入0.1% IV 型膠原酶和0.1%透明質酸酶在37 ℃恒溫箱中輕微振蕩消化2 h。用200 目的不銹鋼篩網去除未消化組織，收集的濾液以1 500 ×g 室溫下離心5 min。用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基的細胞懸液小心平鋪于淋巴細胞分離液之上，以2 000 × g、22 ℃離心30 min。收集白色云霧狀的淋巴細胞層，PBS 充分洗滌。臺盼藍染色，收集的細胞大于95%的活細胞率可用于后續的流式檢測。由于單個標本收集的淋巴細胞大約有1 ×107/L，所以我們通常將來自同組的2個標本的淋巴細胞合并為1 個檢測樣本。

調整外周血和子宮內膜的淋巴細胞濃度為每管1 ×109/L。每管加入CD4-FITC 和CD25-PE 抗體，4 ℃避光孵育30 min。PBS 洗滌后，進行固定破膜。然后，每管加入Foxp3-Alexa Fluor? 647 抗體，4 ℃避光孵育30 min。Alexa Fluor? 647 小鼠IgG1κ 亞型作為同型對照抗體。洗滌后，200 μL PBS 重懸，進行流式細胞檢測。外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞和子宮內膜CD4+Foxp3+Treg 細胞的百分比用WinMDI 2.9 軟件分析獲得。

6 妊娠大鼠著床點子宮內膜Foxp3 蛋白的檢測(Western blotting)

著床點子宮內膜被剪碎后放于預冷的RIPA 裂解液中在冰上研磨成勻漿狀。冰上靜置30 min。然后4 ℃、12 000 ×g 離心20 min。上清被收集分裝放于-80 ℃冰箱中。蛋白濃度用BCA 試劑盒定量，酶標儀分析。將加了上樣緩沖液的蛋白98 ℃蒸煮10 min 后，加入10%SDS-PAGE 中電泳，然后將分離的蛋白轉移至NC 膜上。5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h后，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜(β-actin 1 ∶200;Foxp3 1∶500)。漂洗后，HRP 標記的山羊抗大鼠IgG(1∶20 000)室溫下孵育1 h。然后根據說明書進行ECL 曝光。掃描膠片，用Quantity One 軟件獲得積分光密度值。每個樣本的蛋白表達水平以目的蛋白/β-actin 的吸光度比值來表示。

7 妊娠大鼠著床點子宮內膜Foxp3 mRNA 的檢測(real-time PCR)

按照說明書，將剪碎的著床點子宮內膜置于預冷的TRIzol 中提取RNA。取2 μL RNA 用核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度后，用PrimeScript RT reagent Kit 將其逆轉錄成cDNA，反應條件為:37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃穩定儲存在-20 ℃冰箱中。然后在20 μL 體系下進行擴增:10 μL SYBR Premix Ex Taq(2 ×)，2 μL cDNA 樣品，10 μmol/L 的引物各0.4 μL(引物序列詳見表1)，0.4 μL ROX Reference Dye(50 ×)，6.8 μL 無菌DECP 水。反應條件為:95℃30 s，1 個循環;95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環;95℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，1 個循環。其中每個樣本做2 個復孔，β-actin 為內參照。每個標本的相對mRNA 含量通過2-ΔΔCt計算得到。

表1 Foxp3 和β-actin 的引物序列Table 1. The primer sequences of Foxp3 and β-actin

8 統計學處理

采用SPSS 15.0 統計軟件分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示。數據服從正態分布時，采用單因素方差分析進行統計處理(數據滿足方差齊性條件選擇LSD 檢驗，如果不滿足，則用Dunnett’s T3 檢驗);數據不服從正態分布時，則用非參數Kruskal-Wallis 和Mann-Whitney U-tests 檢驗;以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組妊娠大鼠平均著床胚胎數比較

如表2 所示，與N 組相比，M 組的著床胚胎數明顯減少，差異有統計學意義(P ＜0.05);而與M 組相比，A 組和W 組的著床胚胎數顯著增多(P ＜0.05)。

表2 大鼠妊娠第8、10 天的著床胚胎數Table 2. The number of implanted embryos in rats on day 8 and day 10 of pregnancy(mean±SD.n=24)

2 各組妊娠大鼠外周血CD4+淋巴細胞中CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞的比例

與N 組相比，M 組大鼠妊娠第6、8、10 天外周血CD4+CD25+Foxp3+細胞/CD4+細胞的比例顯著下降，差異有統計學意義(P ＜0.05);與M 組相比，A組和W 組大鼠妊娠第6、8、10 天外周血CD4+T 細胞中表達CD25+Foxp3+的頻率明顯增高(P ＜0.05);A組與W 組之間CD4+CD25+Foxp3+細胞的比例無明顯差異(P ＞0.05)，見圖1。

3 各組妊娠大鼠子宮內膜淋巴細胞中CD4+Foxp3+Treg 細胞的比例

妊娠大鼠子宮內膜Treg 細胞的相對含量通過CD4+Foxp3+細胞/淋巴細胞來表示。如圖2 所示，M組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜淋巴細胞中CD4+Foxp3+Treg 細胞的百分比顯著低于N 組，差異有統計學意義(P ＜0.05);與M 組相比，W 組大鼠妊娠第6、8、10 天和A 組大鼠妊娠第8、10 天子宮內膜淋巴細胞中CD4+Foxp3+Treg 細胞的比例均明顯增高，差異有統計學意義(P ＜0.05)，而A 組大鼠妊娠第6天子宮內膜淋巴細胞中CD4+Foxp3+Treg 細胞的比例差異雖未達到統計學意義，但也有一定程度的增高趨勢;A 組與W 組之間CD4+Foxp3+Treg 細胞的比例無明顯差異(P ＞0.05)。

Figure 2. The percentage of CD4 +Foxp3 +Treg cells in rat endometrium on day 6，day 8 and day 10 of pregnancy detected by flow cytometry.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05 vs group N;#P ＜0.05 vs group M.圖2 流式細胞術檢測大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜CD4 +Foxp3 +Treg 細胞的比例

4 各組妊娠大鼠著床點子宮內膜Foxp3 蛋白的表達

與N 組相比，M 組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜Foxp3 蛋白的表達顯著降低，差異有統計學意義(P ＜0.05);與M 組相比，A 組大鼠妊娠第6、8 天子宮內膜Foxp3 蛋白的表達和W 組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜Foxp3 蛋白的表達均顯著上升(P ＜0.05)，而A 組大鼠妊娠第10 天子宮內膜Foxp3 蛋白的表達未達到顯著差異;A 組與W 組之間Foxp3蛋白的表達無明顯差異(P ＞0.05)，見圖3。

Figure 3. The expression of Foxp3 protein in rat endometrium on day 6，day 8 and day 10 of pregnancy detected by Western blotting. Mean ± SD. n = 6. * P ＜0.05 vs group N;#P ＜0.05 vs group M.圖3 Western blotting 檢測大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜Foxp3 蛋白的表達

5 各組妊娠大鼠著床點子宮內膜Foxp3 mRNA 的表達

與N 組相比，M 組大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜Foxp3 mRNA 的表達明顯下降(P ＜0.05);與M組相比，A 組大鼠妊娠第6、10 天和W 組大鼠妊娠第6、8 天子宮內膜Foxp3 mRNA 表達均顯著增高(P ＜0.05);A 組與W 組之間Foxp3 mRNA 的表達無明顯差異(P ＞0.05)，見圖4。

討 論

Figure 4. The expression of Foxp3 mRNA in rat endometrium on day 6，day 8 and day 10 of pregnancy detected by real-time PCR.Mean±SD.n =6. * P ＜0.05 vs group N;#P ＜0.05 vs group M.圖4 Real-time PCR 檢測大鼠妊娠第6、8、10 天子宮內膜Foxp3 mRNA 表達

在懷孕過程中，作為半同種移植物的孕體要想順利在子宮內膜著床和生長發育并非易事，需要應對母體先天免疫反應和適應性免疫反應的免疫排斥［6］。在適應性免疫反應中，母體淋巴細胞不是被屏蔽，而是時刻準備著與父系的MHC 和其它孕體抗原反應［7］。為了阻止應答的淋巴細胞對孕體的細胞毒性損傷，母體的免疫耐受被激活。這種免疫耐受一定程度上由CD4+CD25+調節性T細胞進行調節［1］。CD4+CD25+調節性T 細胞是一個獨特的T細胞亞型，主要來源于胸腺，能夠有力地抑制炎癥I型免疫反應的產生和功能發揮。CD4+CD25+調節性T 細胞有無能性和免疫抑制性兩大功能特點。Foxp3 特異表達在CD4+CD25+調節性T 細胞上，對CD4+CD25+調節性T 細胞的分化發育和功能至關重要［8］。妊娠期的CD4+CD25+調節性T 細胞大部分是Foxp3 陽性細胞［3］。

CD4+CD25+調節性T 細胞在正常妊娠生理中是必須的。人類妊娠早期外周血中CD4+CD25+調節性T 細胞開始增加，在妊娠中期達到高峰，以后逐步下降，產后下降至稍高于懷孕前水平［2-3］。在流產和不明原因的自發性流產婦女的子宮內膜中存在CD4+CD25+調節性T 細胞數量下降［9］和調節異常［10］。懷孕早期的婦女蛻膜中Foxp3+細胞明顯增加［11］，而在不明原因的不孕婦女中分泌期子宮內膜Foxp3 mRNA 的表達是降低的，子宮內膜Foxp3 mRNA 的表達下降可能減弱子宮CD4+CD25+調節性T細胞的分化，從而導致著床失敗［12］。CD4+CD25+調節性T 細胞在妊娠中的作用同樣在鼠類中得到證實。Aluvihare 等［1］觀察到妊娠期的C57BL/6 小鼠的脾臟、腹股溝淋巴結和血液中的CD4+CD25+調節性T 細胞明顯高于未孕者。有流產傾向的CBA/J 雌鼠懷孕后，子宮內膜組織中CD4+CD25+調節性T 細胞減少且自發流產率升高，但是通過來自正常懷孕小鼠的Treg 細胞的過繼移植，可使CBA/J 雌鼠蛻膜組織中Foxp3 mRNA 水平升高，同時降低了胎兒自發流產率［13］。上述研究表明CD4+CD25+Foxp3+調節性T 細胞是成功妊娠的重要調節者。

在本研究中，我們統計了各組大鼠妊娠第8、10天的著床胚胎數。M 組大鼠的著床胚胎數明顯低于N 組，而A 組大鼠的著床胚胎數則明顯高于M 組，表明我們成功建立了胚胎著床障礙模型，同時再次證實了針刺對大鼠胚胎著床障礙有改善作用。此外，我們利用流式細胞術檢測了各組孕鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞和著床點子宮內膜CD4+Foxp3+Treg 細胞的比例，結果顯示:M 組大鼠妊娠第6、8、10 天 外 周 血CD4+T 細 胞 中CD4+CD25+Foxp3+細胞比例明顯低于N 組，而A 組大鼠妊娠第6、8、10 天 外 周 血CD4+T 細 胞 中CD4+CD25+Foxp3+細胞比例明顯高于M 組，且與W 組相比無明顯差異;M 組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點子宮內膜CD4+Foxp3+細胞的比例明顯低于N 組，而A 組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點子宮內膜CD4+Foxp3+細胞的比例不同程度地高于M 組，且與W 組之間無明顯差異。這說明針刺不僅提高了胚胎著床障礙大鼠外周血調節性T 細胞的比例，而且也在一定程度上提高了著床點子宮內膜調節性T 細胞的比例。我們進一步研究了著床點子宮內膜Foxp3 蛋白和mRNA 的表達，發現M 組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點子宮內膜Foxp3 蛋白和mRNA 的表達明顯低于N 組，而A組大鼠妊娠第6、8、10 天著床點子宮內膜Foxp3 蛋白和mRNA 的表達不同程度地高于M 組，且與W 組相比無明顯差異。這證明了Foxp3 在大鼠妊娠早中期的重要作用，同時也表明針刺可能促進Foxp3 在著床障礙大鼠子宮內膜上的表達，這也為針刺能夠促進Treg 細胞在大鼠子宮內膜上的分布和功能的發揮提供了更多的證據。Polanczyk 等［14］和Prieto 等［15］認為雌激素能增加體內外Foxp3 的表達以及CD4+CD25+細胞的數量和功能。另外，最近也有研究顯示，孕酮能夠使培養的CD4+CD25-細胞轉化為CD4+CD25+細胞，孕酮拮抗劑RU486(米非司酮)抑制這種轉化;當卵巢切除小鼠和假孕模型小鼠被給予孕酮后，這種轉化仍被抑制;孕酮通過細胞核孕激素受體使Treg 細胞增加［16］。這說明雌、孕激素在CD4+CD25+Foxp3+Treg 細胞發育和功能發揮中起重要作用。Treg 細胞主要來源于胸腺，子宮內膜局部的Treg 細胞有可能是從外周募集過來的，因此我們推測針刺可能通過調節激素的變化，提高大鼠外周血Treg 細胞的比例，促使這些細胞在著床點子宮內膜的聚集，從而使調節性T 細胞免疫耐受功能得到發揮，進而維持妊娠的順利進行。

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