紫杉醇聯(lián)合順鉑化療對人卵巢漿液性囊腺癌組織occludin 和ZO-1 表達以及線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響*

譚樹芬， 楊宏英， 李 凡， 魏向群， 李樹清△

(昆明醫(yī)科大學(xué)1第三附屬醫(yī)院婦瘤科，2病理生理教研室，云南 昆明650118)

卵巢漿液性囊腺癌(serous cystadenocarcinoma，SC)是最常見的卵巢上皮惡性腫瘤，約占全部卵巢腫瘤的40%，占卵巢上皮性癌的50% ～60%。當(dāng)前，鉑類藥物對卵巢癌仍然是最重要的化療藥物［1-2］。新近研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接(tight junction，TJ)膜蛋白結(jié)構(gòu)的缺失可能是導(dǎo)致細胞黏附能力丟失和腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟［3-4］，其在卵巢惡性腫瘤表達的差異可能成為卵巢癌診治的標(biāo)志物［1］。TJ 的occludin 和zonula occludens-1 (ZO-1)蛋白是控制內(nèi)皮或上皮細胞之間連接的關(guān)鍵物質(zhì)，具有維持細胞極性、黏附性、運動性、調(diào)節(jié)細胞增殖及分化的功能［5］，盡管紫杉醇聯(lián)合鉑類是迄今認為最有效的化療方案，但其對SC 細胞occludin 和ZO-1 表達的作用尚不清楚。本文旨在觀察紫杉醇聯(lián)合順鉑化療對SC 細胞occludin 及ZO-1 表達的影響。

材 料 和 方 法

1 對象

20 例卵巢癌組織石蠟標(biāo)本，取自昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦瘤科2009 年～2012 年間行卵巢癌切除術(shù)的患者，年齡30 ～70 歲。分組原則:對于手術(shù)治療無困難的卵巢腫瘤患者，住院后直接實施手術(shù)治療。若手術(shù)治療困難的患者，先行B 超引導(dǎo)穿刺活檢，當(dāng)確診為卵巢癌后進行化療，待腫瘤體積縮小后再行手術(shù)切除。石蠟標(biāo)本均制成厚約4 μm 的連續(xù)組織切片2 份，其中一份進行HE 染色和病理組織學(xué)檢查，另一份標(biāo)本進行免疫組化染色。以3 例知情同意后的子宮肌瘤患者的卵巢組織作為正常對照組。化療方案:紫杉醇加鉑類化療，具體為紫杉醇按175 mg/m2，鉑類選擇順鉑，按70 mg/m2靜滴。

2 方法

2.1 電子顯微鏡觀察 將患者術(shù)中切除的卵巢及時取組織塊，置于3.5%戊二醛內(nèi)保存，磷酸鹽緩沖液沖洗后，丙酮酸逐級脫水，1%四氧鋨酸固定24 h，超薄切片機半薄切片定位，再作檸檬酸鉛醋酸鈾雙染色，在JEM-1011 型電子顯微鏡下進行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察。

2.2 緊密連接蛋白的免疫組化檢測 采用免疫組化MaxVision 快捷法進行occludin 及ZO-1 檢測。操作步驟:常規(guī)固定包埋卵巢癌樣本，石蠟切片脫蠟、梯度乙醇脫水后，浸泡于蒸餾水中待用。組織高壓抗原修復(fù):將水洗后的切片浸泡于0.01 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中，在壓力鍋內(nèi)加熱至沸騰(10 min);將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫染色架上，放入已沸騰的緩沖液內(nèi)繼續(xù)加熱至工作溫度和工作壓力(噴汽)2 min 后，壓力鍋離開熱源。數(shù)分鐘后，沖淋冷卻蒸餾水沖洗2 次。3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 沖洗3 min ×3 次，非免疫小牛血清封閉抗原(10 min)，甩去血清，勿沖洗;用PBS(pH 7.4)沖洗3 min ×3 次，除去PBS 液，每張切片加50 μL 的第Ⅰ抗體(1∶100 稀釋)，4 ℃冰箱下孵育過夜。PBS 沖洗5 min ×3 次。除去PBS 液，每張切片加50 μL 酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物(Ⅱ抗)，室溫下孵育15 min。PBS 沖洗3 min ×3 次。除去PBS 液，每張切片加50 μL 新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察5 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，用0.1% HCl 分化，自來水沖洗返藍。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用正常卵巢組織(取自子宮肌瘤患者切除的卵巢組織)標(biāo)本作為正常對照，以PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。

2.3 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 所有石蠟切片由病理科醫(yī)師獨立評判后綜合評定。Occludin 和ZO-1 陽性物在細胞漿呈細顆粒狀棕黃色反應(yīng)。在相同電壓及相同光亮度條件下，用20 倍物鏡攝取以上各區(qū)域的圖像傳送至計算機顯示屏，用Nikon-MiVnt 顯微圖像分析系統(tǒng)進行免疫組化圖像定量分析，所測得陽性細胞平均灰度值表示occludin 和ZO-1 陽性表達信號的相對強弱。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件包，行單因素方差分析，方差齊性檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 化療對人卵巢SC 細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響

電鏡觀察顯示，正常卵巢上皮細胞超微結(jié)構(gòu)正常，形狀排列規(guī)則，線粒體未見異常。SC 細胞頂端可見小而粗短的微絨毛，以不規(guī)則的方式突向腔面，基底部細胞膜則多呈平滑狀，核位于基底部;線粒體明顯腫脹，位于細胞體部，呈現(xiàn)巨線粒體，且嵴斷裂十分顯著。化療后SC 細胞排列較規(guī)則，線粒體腫脹消失、線粒體體積明顯減小，形態(tài)接近正常，見圖1。

2 化療對人卵巢SC 組織緊密連接蛋白(occludin和ZO-1)表達的影響

免疫組化結(jié)果顯示，對照組卵巢上皮細胞occludin 和ZO-1 蛋白強表達，胞漿內(nèi)有較多棕黃色陽性物，定位準(zhǔn)確，表達清楚，背景清晰，胞核經(jīng)蘇木素復(fù)染，呈藍黑色;SC 細胞occludin 和ZO-1 蛋白弱表達，胞漿內(nèi)僅見少量棕黃色陽性物，藍黑色的胞核更加明顯，與對照組相比灰度值明顯升高(P ＜0.05 或P ＜0.01);化療組SC 細胞occludin 和ZO-1 表達增強，胞漿內(nèi)有較多棕黃色陽性物，定位準(zhǔn)確，表達清楚，背景清晰，胞核亦呈藍黑色，與SC 組相比灰度值明顯降低(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖2。

Figure 1. Effects of paclitaxel-cisplatin combination chemotherapy on ultrastructural changes of human ovarian serous cystadenocarcinoma (SC)cells.圖1 化療對人卵巢SC 細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

Figure 2. Effects of paclitaxel-cisplatin combination chemotherapy on the expression of occludin and ZO-1 in human ovarian serous cystadenocarcinoma (SC)tissues (×200).Mean±SD. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs SC.圖2 化療對人卵巢SC 組織緊密連接蛋白表達的影響

討 論

卵巢癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的常見疾病，由于其死亡率一直居高不下而成為當(dāng)前國際腫瘤研究的重要領(lǐng)域。近年來，雖然化療方案的不斷完善與應(yīng)用，但卵巢惡性上皮性腫瘤的療效卻未見明顯改善。卵巢癌的5 年生存率之所以總是徘徊于30% ～40%之間，其最重要的原因就是癌轉(zhuǎn)移之前的早期診斷十分困難。因此，開展卵巢癌發(fā)病規(guī)律、病理特點以及分子生物學(xué)的研究與探索具有極其重要的實踐意義，也是當(dāng)前卵巢癌防治研究的重要領(lǐng)域。TJ 主要由跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白組成。跨膜蛋白occludin 是第1 個被發(fā)現(xiàn)的TJ 蛋白［3］，其N 端對TJ 的裝配和屏障功能的保持起重要作用，C 端與ZO-1 直接相連，與ZO-1 共同調(diào)節(jié)緊密連接的結(jié)構(gòu)變化，此特點對occludin 在TJ 間的定位及細胞間的通透性調(diào)節(jié)極其重要。ZO-1 是第1 個被證實的TJ 附著蛋白，它與occludin 位于胞質(zhì)內(nèi)的C 端直接相連［4，6］。TJ 中的occludin 和ZO-1 是控制物質(zhì)穿過內(nèi)皮和上皮細胞間連接的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，具有維持細胞極性、黏附性、運動性、調(diào)節(jié)細胞增殖及分化的功能［3］。當(dāng)組織惡變時，TJ 的功能異常可導(dǎo)致細胞極性破壞，表明TJ 蛋白可能是藥物靶向一種特殊分子。免疫組化研究顯示，SC 組織occludin 和ZO-1 表達明顯減弱，而化療組卵巢上皮細胞occludin 和ZO-1 表達明顯增強，可能是緩解細胞水腫及線粒體腫脹的關(guān)鍵所在。

國外學(xué)者認為，線粒體在順鉑抗腫瘤作用中具有的重要價值，因此將探索的注意力在集中到順鉑與線粒體的相互作用方面［1］。我們對SC 的超微結(jié)構(gòu)觀察顯示，SC 線粒體腫脹和嵴斷裂的改變明顯。已證明，嵴型腫脹一般為可逆性，倘若膜損傷明顯加重時，可經(jīng)過混合型腫脹而過渡為基質(zhì)型腫脹。SC細胞的巨型線粒體可能是此型腫瘤惡性度較高的原因之一。化療組卵巢線粒體腫脹明顯減輕與occludin 和ZO-1 表達增強相平行，提示二者在保持卵巢的結(jié)構(gòu)與功能中可能具有重要作用。TJ 在卵巢惡性腫瘤轉(zhuǎn)化中表達的不同特點有望成為卵巢癌診治的重要標(biāo)志物［3］。已證明，腫瘤細胞暴露于順鉑最終導(dǎo)致細胞凋亡，僅1%的細胞內(nèi)鉑可綁定到核DNA，而絕大多數(shù)細胞內(nèi)的藥物可與其它分子相互作用，包括線粒體DNA［7-8］。Lee 等［9］的研究證實，卡鉑可使Bax 水平升高，而Akt 抑制劑則使Bax 水平下調(diào)，表明Akt 抑制劑可通過增加caspase-8 以及線粒體細胞色素C 的釋放而加強卡鉑對卵巢癌細胞的攻擊效應(yīng)。鑒于大部分化療藥物作用于腫瘤細胞時都會產(chǎn)生活性氧而引起氧化應(yīng)激［10］，其與TJ 蛋白表達以及線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)間的分子機制有待進一步研究。

(致 謝:本文統(tǒng)計學(xué)處理承蒙昆明醫(yī)科大學(xué)沈凌、陳靜老師大力協(xié)助，謹(jǐn)此致謝!)

［1］ Saitou M，Isonishi S，Hamada T，et al.Mitochondrial ultrastructure-associated chemotherapy response in ovarian cancer［J］. Oncol Rep，2009，21(1):199-204.

［2］ 鄧曉慧，宋海巖，孫春莉. 槲皮素對人卵巢癌SKOV-3細胞增殖的影響［J］.中國病理生理雜志，2013，29(1):99-102.

［3］ Li D，Mrsny RJ. Oncogenic Raf-1 disrupts epithelial tight junctions via downregulation of occluding［J］. J Cell Biol，2000，148(4):791-800.

［4］ 尹 芳，喬泰東，時永全，等. 緊密連接分子Occludin mRNA 在胃癌中的表達和分布［J］. 中華腫瘤雜志，2002，24(6):557-560.

［5］ Zhu Y，Br?nnstr?m M，Janson PO，et al. Differences in expression patterns of tight junction proteins，clandin-1，3，4，and 5，in human ovarian surface epithelium as compared to epithelia in inclusion cysts and epithelial ovarian tumours［J］. Int J Cancer，2006，118(8):1884-1891.

［6］ Müller SL，Portwich M，Schmidt A，et al. The tight junction protein occludin and the adherens junction protein αcatenin share a common interaction mechanism with ZO-1［J］. J Biol Chem，2005，280(5):3747-3756.

［7］ Hirama M，Isonishi S，Yasuda M，et al. Characterization of mitochondria in cisplatin-resistant human ovarian carcinoma cells［J］. Oncol Rep，2006，16(5):997-1002.

［8］ 汪 輝，黃亞非，李 天，等.卵巢癌細胞對CD8+T 細胞ζ 鏈表達及分泌Tc1/Tc2 型細胞因子的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24(1):97-100.

［9］ Lee CS，Kim YJ，Jang ER，et al.Akt inhibitor enhances apoptotic effect of carboplatin on human epithelial ovarian carcinoma cell lines［J］. Eur J Pharmacol，2010，632(1-3):7-13.

［10］蔡鵬程，張德太，楊菊紅，等. 順鉑對HeLa 細胞6-磷酸葡萄糖脫氫酶表達和活性的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24(7):1323-1326.