美托洛爾對心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞磷酸化縫隙連接蛋白43 表達(dá)及心肌細(xì)胞凋亡的影響*

梁 慶， 李自成， 鄺素華， 黃偉青， 黃敏堅， 林俊敏， 梁子敬

(1暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科，廣東 廣州510632;廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院2急診科，3心臟外科，廣東 廣州510120)

連接蛋白43(connexin 43，Cx43)是心臟中表達(dá)最豐富的連接蛋白，其構(gòu)成的間隙連接(gap junction，GJ)通道在心肌細(xì)胞中的電耦聯(lián)及化學(xué)信息交流中起著非常重要的作用。近期，Salameh 等［1］的研究發(fā)現(xiàn)美托洛爾(metoprolol，Meto)不同異構(gòu)體均能阻止GJ通道Cx43 的降解而上調(diào)離體乳鼠心肌細(xì)胞GJ 通道Cx43 表達(dá)。Cx43 的磷酸化與去磷酸化對GJ 通道的功能有著非常重要的調(diào)控作用。β 腎上腺素受體阻滯劑可對抗心力衰竭(heart failure，HF)時神經(jīng)內(nèi)分泌的長期持續(xù)激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，而其內(nèi)在機制是否與Cx43 表達(dá)及磷酸化調(diào)控相關(guān)，目前仍不清楚。本文觀察Meto 對心力衰竭大鼠在體心肌細(xì)胞磷酸化Cx43(phosphorylated connexin 43，p-Cx43)表達(dá)水平及心肌細(xì)胞凋亡影響，并探討其可能機制。

材 料 和 方 法

1 心力衰竭模型的復(fù)制及實驗分組

SPF 級雄性SD 大鼠100 只，體重180 ～200 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供(合格證號為0096235)。動物隨機化分為5 組:(1)假手術(shù)組(sham，n=20);(2)心力衰竭模型組(HF，n =20);(3)美托洛爾治療低劑量組(MetoA，n =20);(4)美托洛爾治療中劑量組(MetoB，n =20);(5)美托洛爾治療高劑量組(MetoC，n =20)。施行腹主動脈次全結(jié)扎術(shù)，將7 號注射針頭(去尖)與大鼠左腎動脈上方1.0 ～1.5 cm 處的腹主動脈緊貼并共同結(jié)扎后抽出針頭，造成腹主動脈狹窄70% ～80%，從而建立壓力負(fù)荷型心力衰竭動物模型，sham 組不結(jié)扎腹主動脈，其余操作同模型組。大鼠術(shù)后喂養(yǎng)8 周，美托洛爾治療組大鼠術(shù)后第4 周開始每日分2 次灌胃給藥(酒石酸美托洛爾片，阿斯利康制藥有限公司)(日劑量:MetoA 組1.25 mg·kg-1·d-1;MetoB 組5 mg·kg-1·d-1;MetoC 組20 mg·kg-1·d-1)，sham 組和HF 組正常喂養(yǎng)。術(shù)后4 周及8 周行心臟超聲心動圖測定心功能，術(shù)后8 周測定心功能后取大鼠心臟進(jìn)行下游實驗。大鼠的處置符合暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會的相關(guān)管理規(guī)定。

2 常規(guī)心電圖和心臟超聲心動圖動態(tài)監(jiān)測

術(shù)后第4 周及第8 周用6 ～12 MHZ 高頻線陣探頭取各組大鼠胸骨旁左室長軸切面及腹主動脈長軸切面連續(xù)檢測左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diastolic diameter，LVIDd)，舒張末期室間隔厚度(interventricular septal diastolic thickness，IVSd)和左室后壁厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness，LVPWd)及左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。所有超聲心動圖檢查均由一位具有豐富超聲心動圖檢查經(jīng)驗的心臟專科醫(yī)生完成。造模術(shù)前與術(shù)后4 周、8 周常規(guī)心電監(jiān)測。

3 大鼠心臟取材

大鼠術(shù)后8 周檢測心功能后，立即開胸取出心臟，置冰上去除心耳心房，平行于房室溝于左室長軸中點處將心室分為心尖部和心底部，心尖部用于Western blotting 檢測;心底部用4%多聚甲醛固定12 h 后，石蠟包埋，切片后HE 和Masson 染色觀察心臟結(jié)構(gòu)改變及膠原纖維增生情況，末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡。

4 Western blotting 半定量檢測p-Cx43 表達(dá)

冰上提取大鼠心尖部左心室總蛋白后測定總蛋白質(zhì)濃度，每孔加入50 μg 總蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS -PAGE(10%分離膠)電泳，電轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。1∶400 p-Cx43 兔抗鼠多克隆抗體(購自Cell Signaling Technology)4 ℃孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(1∶2 000)室溫下孵育2 h，以GAPDH(1∶2 000)抗體作內(nèi)參照。洗膜后ECL 試劑顯影。

5 TUNEL 法檢測心肌細(xì)胞凋亡

采用TUNEL 檢測試劑盒(購自南京凱基生物科技有限公司)檢測各組大鼠心肌組織中的凋亡細(xì)胞。光鏡下正常細(xì)胞核顯藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈深淺不一棕黃色(TUNEL 陽性)。每只大鼠觀察4 張切片，每張切片上隨機選取計數(shù)5 個視野(×400)，計算每個視野內(nèi)凋亡陽性細(xì)胞核數(shù)占總細(xì)胞總數(shù)百分比，取其平均值為心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊采用LSD 法，方差不齊采用Games-Howell 法;變量間的相關(guān)性作Pearson 直線相關(guān)分析。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 美托洛爾對心功能的影響

各實驗組術(shù)中無大鼠死亡，腹主動脈次全結(jié)扎術(shù)后喂養(yǎng)8 周，各組大鼠存活只數(shù)如下:(1)sham 組18 只;(2)HF 組14 只;(3)MetoA 組16 只;(4)MetoB 組18 只;(5)MetoC 組15 只，見表1。

從表1 中可見，在第8 周(給藥4 周后)，與sham組相比，HF 組及Meto 治療組的心率均有減慢(P ＜0.01);而與HF 組相比，MetoA 組的心率無明顯減慢(P ＞0.05)，MetoB 組(P ＜0.05)及MetoC 組(P ＜0.01)顯著減緩心衰大鼠心率，Meto 治療組間比較有顯著差異。HF 組和Meto 治療組的LVIDd 較sham組明顯增大，Meto 治療組的LVIDd 較HF 組顯著縮小。Meto 治療組間進(jìn)一步比較顯示，中劑量MetoB組LVIDd 較小劑量MetoA 組進(jìn)一步縮小(P ＜0.05)，而大劑量MetoC 組較中劑量組LVIDd 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。HF 組及Meto 治療組的IVSd 和LVPWd 較sham 組明顯增厚，Meto 治療組的IVSd 和LVPWd 均較HF 組顯著減小，Meto 治療組間比較顯示，中劑量組IVSd 和LVPWd 較小劑量組進(jìn)一步減小(P ＜0.05)，而大劑量組IVSd 和LVPWd 較中劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。與sham 組相比，HF 組EF 為(44.71 ±9.68)%，心功能明顯惡化(P ＜0.01);MetoA 組及MetoB 組的心功能較HF組顯著改善(P ＜0.01)，而MetoC 組心功能較HF 組無明顯改善(P ＞0.05)。從上述結(jié)果可見本實驗壓力負(fù)荷型心力衰竭大鼠建模成功，心肌出現(xiàn)不同程度的肥厚、重塑等結(jié)構(gòu)改變，且心功能惡化明顯;與HF 組比較，經(jīng)中、小劑量Meto 治療后大鼠心臟LVIDd 縮小，IVSd 和LVPWd 增厚減輕，心功能改善明顯，而大劑量Meto 治療顯著減緩心衰大鼠心率，心功能較HF 組無明顯改善，且大劑量組較中劑量組LVIDd 縮小及IVSd 和LVPWd 增厚程度均無顯著差異，顯示美托洛爾治療對心衰大鼠血流動力學(xué)改變有“天花板效應(yīng)”。

表1 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)及血流動力學(xué)指標(biāo)的比較Table 1. Rat cardiac structure and hemodynamic indicators in various groups (Mean±SD)

2 心肌病理結(jié)果

HE 染色(圖1)可見，sham 組心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，心肌纖維排列整齊，心肌間質(zhì)無增生。而HF 組心肌細(xì)胞炎性細(xì)胞浸潤，心肌細(xì)胞肥大明顯，心肌間質(zhì)增生明顯，部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)空泡樣變性、細(xì)胞溶解及出現(xiàn)纖維化并呈現(xiàn)波浪狀，排列紊亂，局部斷裂，有出血和炎癥表現(xiàn)，進(jìn)一步Masson 染色(圖2)顯示心肌膠原纖維(標(biāo)示為藍(lán)色部分)增生明顯。而HE 染色(圖1)可見各Meto 治療組缺血區(qū)心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂、空泡樣變性、細(xì)胞溶解及炎癥細(xì)胞浸潤均較HF 組改善明顯，且隨劑量增加心肌細(xì)胞病理改變有進(jìn)一步改善。Masson 染色(圖2)亦顯示隨Meto 治療劑量的增加心肌膠原纖維增生得到進(jìn)一步抑制。上述病理表現(xiàn)提示美托洛爾治療對于心肌重塑改變的逆轉(zhuǎn)有“劑量依賴效應(yīng)”，在治療劑量范圍內(nèi)劑量的增加可有效逆轉(zhuǎn)心力衰竭時心肌肥大、壞死、纖維化，以及心肌胞外間質(zhì)、膠原纖維網(wǎng)的增生。

Figure 1. Myocardial HE staining in various groups (×200).A:sham group;B:HF group;C:MetoA group;D:MetoB group;E:MetoC group.圖1 各組大鼠心肌HE 染色

Figure 2. Myocardial Masson staining in various groups (×200).A:sham group;B:HF group;C:MetoA group;D:MetoB group;E:MetoC group.圖2 各組大鼠心肌Masson 染色

3 Western blotting 結(jié)果

圖3 顯示，在分子量43 kD 處可見p-Cx43 清晰的表達(dá)條帶。HF 組p-Cx43 條帶較sham 組明顯增粗，予Meto 治療后p-Cx43 條帶隨治療劑量的增加而變細(xì)變淡。進(jìn)一步半定量分析顯示，HF 組中p-Cx43表達(dá)量較sham 組顯著升高(P ＜0.01)，而Meto 各治療組較HF 組p-Cx43 表達(dá)量均顯著降低(MetoA vs HF，P ＜0.05;MetoB vs HF，P ＜0.01;MetoC vs HF，P ＜0.01)，Meto 各治療組間兩兩比較亦有顯著差異(P ＜0.01)。

4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化

大鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化如下:sham 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(4.62 ±1.60)%;HF 組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)為(51. 17 ±6. 94)%，較sham 組明顯升高(P ＜0.01);MetoA 組凋亡指數(shù)為(40.60 ±4.15)%，MetoB 組凋亡指數(shù)為(30.66 ±4.00)%，MetoC 組凋亡指數(shù)為(22. 24 ±5. 69)%，均較HF 組顯著下降(P ＜0.01)，Meto 各治療組間兩兩比較亦有顯著差異(P ＜0.01)，見圖4。

5 大鼠心肌細(xì)胞p-Cx43 表達(dá)程度與凋亡水平的相關(guān)性分析

Figure 3. Expression of phosphorylated connexin 43 (p-Cx43)in rat left ventricle in various groups detected by Western blotting. Mean ± SD. ＊＊ P ＜0.01 vs sham group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs HF group.圖3 各組大鼠左心室磷酸化connexin 43 蛋白的表達(dá)水平

Pearson 直線相關(guān)分析顯示，吸光度比值(p-Cx43/GAPDH)與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)呈明顯的正相關(guān)(r=0.905，P ＜0.01)，見圖5。

Figure 4. Myocardial tissue TUNEL staining (×400)and apoptotic index in various groups. A:sham group;B:HF group;C:MetoA group;D:MetoB group;E:MetoC group. Mean ±SD. ＊＊P ＜0.01 vs sham group;##P ＜0.01 vs HF group.圖4 各組心肌組織TUNEL 染色和凋亡指數(shù)

Figure 5. The expression of p-Cx43 and myocardial apoptotic index were positively correlated.圖5 p-Cx43 的表達(dá)與心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)的相關(guān)性分析

討 論

HF 患者中神經(jīng)體液的一個主要特點是神經(jīng)內(nèi)分泌的長期持續(xù)激活，特別是交感神經(jīng)興奮及血漿中去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)水平的升高及尿中兒茶酚胺排泄的增加，而NE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡是HF 發(fā)生的一個重要發(fā)病機制［2-3］。因此通過抑制NE 的心臟毒性從而抑制心肌細(xì)胞凋亡給HF 的治療帶來新希望，而已知β 腎上腺素受體阻滯劑可對抗HF 動物模型或患者中神經(jīng)內(nèi)分泌的長期持續(xù)激活誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡這一效應(yīng)［4-5］。且大量動物研究發(fā)現(xiàn)無論在缺血缺氧前或缺血缺氧中施加GJ通道的阻斷劑，均可顯著限制心肌梗死的范圍和面積［6］。

GJ 通道的基本結(jié)構(gòu)單位是連接小體(connexon)，由6 個Cx 圍成，小體中央形成直徑1.5 nm 的親水管道(hydrophilic channel)，即為Cx 半通道。相鄰細(xì)胞間的Cx 半通道對接而組成完整GJ 通道。Cx構(gòu)成的心臟GJ 通道是心肌細(xì)胞間通訊的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，分子量小于1 kD、直徑小于1.5 nm 的多種物質(zhì)如代謝物、離子、第二信使、水分子等都可通過，并可在電興奮組織中傳導(dǎo)電沖動。Cx43 是心臟中表達(dá)最豐富的Cx，其構(gòu)成的GJ 通道在心肌細(xì)胞中的電偶聯(lián)及化學(xué)信息交流(GJ 通道介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊)中起著非常重要的作用［7］。Cx43 的磷酸化與去磷酸化對GJ通道的功能有著非常重要的影響作用［8］。我們前期的研究表明Cx43 的羧基末端241 ～382 為主要的磷酸化區(qū)，也是多種激素的識別位點，大多數(shù)蛋白質(zhì)相互作用發(fā)生于此，羧基末端絲/蘇氨酸殘基的磷酸化程度決定著GJ 通道的通透性［9］。在心肌細(xì)胞，Cx43的磷酸化使GJ 通道關(guān)閉，去磷酸化使該通道開放。在心肌細(xì)胞，去磷酸化不僅可使GJ 通道開放，而且是通道解聚的關(guān)鍵點，Cx43 一旦去磷酸化，通道即開始解聚為Cx 亞單位，Cx 亞單位可進(jìn)一步降解或轉(zhuǎn)入胞內(nèi)儲存。

近年Salameh 等［10-11］探討了美托洛爾對心肌細(xì)胞Cx43 表達(dá)的影響，對新生鼠心肌細(xì)胞采用美托洛爾單獨或與異丙腎上腺素共同處理，結(jié)果顯示:美托洛爾不同異構(gòu)體均能上調(diào)GJ 通道Cx43 的表達(dá)，認(rèn)為:美托洛爾可阻止GJ 通道Cx43 的降解而發(fā)揮作用，且可能通過有絲分裂原激活蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來實現(xiàn)這一調(diào)控作用。新近研究發(fā)現(xiàn)在Cx43 半通道的開放及胞內(nèi)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signalregulated kinases，ERKs)的激活抑制了骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的凋亡，這與維持細(xì)胞間生存信號(intracellular survival signaling)的交流和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)有關(guān)［12-14］。

本實驗研究中壓力負(fù)荷型HF 大鼠中給予美托洛爾治療后，雖在血流動力學(xué)的改善方面有“天花板效應(yīng)”，而在逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、重塑病理改變方面提示美托洛爾治療有“劑量依賴效應(yīng)”，在治療劑量范圍內(nèi)劑量的增加可有效逆轉(zhuǎn)HF 時心肌肥大、壞死和纖維化，以及心肌胞外間質(zhì)、膠原纖維網(wǎng)的增生。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)HF 對照組大鼠左心室p-Cx43 表達(dá)明顯增加，予美托洛爾治療后p-Cx43 表達(dá)量隨治療劑量的增加而顯著減少，且心肌細(xì)胞凋亡水平與p-Cx43 表達(dá)水平呈正相關(guān)，隨著美托洛爾治療劑量的增加p-Cx43 表達(dá)減少，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)亦減小。結(jié)合上述背景資料和本研究結(jié)果，我們推測美托洛爾對NE 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的抑制可能與維持心臟Cx43 的去磷酸化狀態(tài)而使得Cx43 降解減少和保持GJ 通道開放，從而保證細(xì)胞間生存信號的交流有關(guān)。

總之，美托洛爾對抗HF 時神經(jīng)內(nèi)分泌長期持續(xù)激活誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機制與Cx43 表達(dá)調(diào)控特別是磷酸化狀態(tài)的調(diào)控密切相關(guān)。對其參與細(xì)胞凋亡調(diào)控機制的研究將為臨床應(yīng)用腎上腺素受體阻滯劑治療HF 提供實驗依據(jù)。

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