環氧化酶-2和細胞周期素D1蛋白在膽管癌中的表達及其臨床意義

谷化平 黃 勇 尚培中

我們采用免疫組化方法檢測膽管癌(CHC)、癌旁膽管組織 (TAC)和正常膽管組織(NBDT)中環氧化酶-2(cyclooxy-genase-2,COX-2)和細胞周期素D1(Cyclin D1)蛋白表達狀況，旨在探討其表達水平與CHC發生發展和臨床病理特征的關系，為判斷CHC患者的預后提供生物學參考指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 選取我院2003年01月～2012年09月手術切除并經病理檢查證實的膽管腺癌標本50例。其中男性33例，女性17例，平均年齡(51.8±13.5)歲，年齡23～77歲；高、中分化癌35例、低分化癌15例；有轉移者31例(包括淋巴結、肝、膽囊、腸系膜和胰腺等),無轉移者19例。TNM分期: Ⅰ期10例,Ⅱ期18例，Ⅲ期14例，Ⅳ期8例。以與CHC同期的20例TAC(距瘤緣0.5 cm)和20例NBDT作為對照。標本均經40 g/L中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.1.2 試劑 鼠抗人COX-2和Cyclin D1單克隆抗體和LSAB試劑盒購自邁新生物技術公司(均為即用型)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 免疫組織化學染色采用微波-EliVisionTM(MW- EliVisionTM)法，參照試劑盒說明書進行操作。實驗以已知COX-2和Cyclin D1陽性大腸癌組織作為陽性對照，以枸櫞酸緩沖液代替一抗作為陰性對照。H2O2-DAB顯色。

1.2.2 結果判斷 COX-2陽性產物定位于細胞質、Cyclin D1陽性產物定位于細胞核，呈棕黃色染色者為陽性。采用單盲法，每張切片在400倍顯微鏡下選定10個視野，計算陽性細胞數。陰性(-)：未見棕黃色顆粒；弱陽性(+)：陽性細胞數<25%；陽性(++)：陽性細胞數25%～75%；強陽性(+++)：陽性細胞數>75%。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.0 軟件處理數據，計數資料采用χ2檢驗，免疫組化指標間相關性采用Spearman相關性分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 COX-2和Cyclin D1在膽管良、惡性病變組織中的表達

CHC、TAC 和 NBDT中COX-2陽性表達率分別為78.0%(39/50)、43.3%(13/30)和0(0/20),差異有顯著性(χ2=9.90，χ2=43.03,P<0.05)，TAC 與 NBDT比較有顯著差異性(χ2=8.23，P<0.05)；CHC、TAC 和 NBDT中Cyclin D1陽性表達率分別為68.0%(36/50)、36.7%(11/30)和25.0%(5/20),差異有顯著性(χ2=9.66,χ2=13.01，P<0.05)，TAC 與 NBDT比較無顯著差異性(χ2=0.67，P>0.05)。

2.2 COX-2和Cyclin D1表達與CHC臨床病理參數的關系

COX-2表達與CHC患者性別、年齡和腫瘤分化程度無關(P>0.05),而與腫瘤TNM分期和轉移狀況相關(P<0.05)；Cyclin D1表達與CHC患者性別、年齡無關(P>0.05)，而與腫瘤分化程度、TNM分期和轉移狀況相關(P<0.05)，見表1。

表1 COX-2和Cyclin D1表達與CHC臨床病理參數的關系(例，%)

2.3 膽管癌中COX-2與Cyclin D1表達間的相關性

39例COX-2表達陽性CHC中，Cyclin D1陽性表達有31例(79.5%)；11例COX-2陰性表達CHC中，Cyclin D1陽性表達有5例(45.5%)；CHC組織中COX-2表達與Cyclin D1表達呈顯著正相關(γ=0.32，P<0.05)。

3 討論

近年來腫瘤分子生物學研究表明，惡性腫瘤的形成和轉移的發生是一個多基因、多因子各自發揮或相互協同作用的結果。因此，尋找、研究和揭示腫瘤的相關抗原或標志物與腫瘤的關系，對腫瘤診斷、有效防治、預測預后及術后輔助治療提供依據具有十分重要意義。環氧合酶(cyclooxygenase,COX)又稱前列腺素內過氧化物酶，是前列腺素合成過程中一個重要的限速酶，它可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，從而參與機體的多種病理生理過程，如炎癥、發熱及出凝血機制等。COX是膜結合蛋白，存在于核膜和微粒體膜[1]，它有2種同工酶，即結構型COX-1和誘生型COX-2。COX-2是1種誘導性即刻反應基因，在正常生理狀態下，絕大多數正常組織中檢測不到COX-2表達，只有當細胞受到刺激才能迅速誘導表達COX-2。近年來研究表明，COX-2除在炎癥反應中起重要作用外，尚與腫瘤密切相關，它可通過刺激腫瘤細胞增殖和生長、抑制細胞凋亡、促進腫瘤血管形成、增強細胞侵襲力、抑制機體免疫功能、促進癌前病變向腫瘤轉化等腫瘤的形成[2]。研究證實，包括大腸癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌和肺癌等腫瘤組織中COX-2表達均明顯增高，并與腫瘤的轉移明顯相關[3～7]。本研究結果顯示，在NBDT→TAC→CHC中COX-2表達陽性率逐漸遞增(P<0.05)，并隨著CHC的TNM分期增高和器官轉移其表達陽性率亦隨之顯著增高(P<0.05)。有關COX-2表達與CHC分化程度的關系研究，目前存在不同結論。Kim等[5]研究結果，COX-2表達與CHC分化程度無關。Wu等[8]研究結果，COX-2表達與CHC分化程度有關。本研究結果顯示，COX-2表達與CHC分化程度無關。提示，COX-2在膽管上皮細胞的惡性轉化、臨床進展和轉移過程中起著重要促進作用，可能是CHC發生的早期事件，而對于判斷CHC的惡性程度方面意義不大。

Cyclin D1基因是1種原癌基因，定位于染色體11q13,為細胞周期的正性調控因子，與CDK4/CDK6結合并使之激活，活化的CDK4/CDK6使pRb在G1-S轉換期發生磷酸化，釋放出E2F，進一步激活S期相關基因的轉錄，推動細胞從G1期進入S期，該基因編碼蛋白質的表達失控有可能引起細胞異常增殖而發生腫瘤。目前已發現Cyclin D1蛋白在人類許多惡性腫瘤如乳腺癌、食管癌、胃癌、膽囊癌、胰腺癌等組織中有過表達出現[9～11]。有關Cyclin D1基因在CHC中的研究文獻報道甚少，劉三光等[12]聯合應用流式細胞分析術和逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術，檢測了CHC、TAC 和 NBDT中的Cyclin D1蛋白和mRNA表達水平，結果顯示在CHC、TAC 和 NBDT中，Cyclin D1蛋白和mRNA表達水平均呈現上升趨勢(P<0.05)，認為Cyclin D1基因轉錄和蛋白可能參與了CHC的發生發展過程。本研究結果表明Cyclin D1基因的改變在CHC發生發展過程中起著重要作用，檢測Cyclin D1蛋白表達可作為判斷CHC惡性程度和生物學行為的參考指標之一。

現代醫學研究認為腫瘤的發生是分子事件，是一個涉及多基因、多分子水平變化的多階段過程。本結果顯示，在CHC中COX-2和Cyclin D1表達呈正相關。提示在CHC的發生發展、臨床進展和轉移的病理過程中，COX-2和Cyclin D1可能發揮著協同作用，共同參與了CHC的演化過程。因此，在臨床病理活檢中檢測CHC中COX-2和Cyclin D1蛋白表達，從不同側面更有助于深入了解腫瘤的發生發展，并可為診斷、預后判斷和臨床基因治療提供重要依據。

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