D2-40，Paxillin蛋白在早期胃癌中表達(dá)的相關(guān)性及臨床病理學(xué)意義

許俊龍 張 杰 李玉紅 賈愛華

腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者生存和預(yù)后的重要因素[1]。樁蛋白( Paxillin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能與癌基因結(jié)合的含酪氨酸的黏附調(diào)節(jié)蛋白,已發(fā)現(xiàn)其在腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移過程中起著非常重要的作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。上皮性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移首先要通過侵入淋巴管，隨淋巴流到達(dá)局部淋巴結(jié),而D2-40是比較特異的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物[2]。目前，國內(nèi)外有關(guān)Paxillin、D2-40與早期胃癌的相關(guān)研究甚少，本研究運(yùn)用免疫組化Elivisionplus法檢測Paxillin和D2-40在早期胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)，以探討兩者的表達(dá)與早期胃癌各臨床指標(biāo)間的關(guān)系以及兩者在早期胃癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，判斷其在早期胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集聊城市人民醫(yī)院病理科2002年1月～2012年3月早期胃癌76例蠟塊，所有的病例都做了胃癌根治術(shù)，術(shù)前未接受放、化療，其中男性60例，女性16例，年齡33～83歲，平均年齡61.6歲；乳頭狀腺癌及分化好的冠、管狀腺癌36例，分化差者40例；局限于黏膜層者26例，侵及黏膜肌層者14例，侵及黏膜下層者36例；其中胃漿膜外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者8例。所有病例均進(jìn)行全部胃黏膜取材，用癌周圍基本正常的胃黏膜組織作為對照。全部標(biāo)本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟,高溫高壓熱抗原修復(fù),嚴(yán)格按照免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)操作步驟進(jìn)行免疫組化染色。

1.2 試劑與方法

即用型鼠抗人Paxillin單克隆抗體和即用型D2-40單克隆抗體均購自福州邁新試劑公司。采用免疫組化ElivisionTMplus法。實(shí)驗(yàn)步驟按說明書進(jìn)行。用已知陽性片作陽性對照;用PBS 液代替一抗作陰性對照。

1.3 結(jié)果判斷

采用雙盲法，由2位病理醫(yī)師獨(dú)立觀察每張切片5 個(gè)具有代表性的高倍視野，在組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)志，根據(jù)腫瘤細(xì)胞質(zhì)或核的染色程度及染色細(xì)胞百分率進(jìn)行分析評分：基本不著色為0分，著色淡黃為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細(xì)胞占計(jì)數(shù)細(xì)胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分，將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分各自相乘為其最后得分，0～1 分為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～6 分為中等陽性(++)，6分以上為強(qiáng)陽性(+++)。

Paxillin主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，觀察5個(gè)視野,每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,共計(jì)1000個(gè),以細(xì)胞無棕黃色或與背景一致的淺棕黃色為陰性細(xì)胞,細(xì)胞中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞百分率。D2-40陽性表達(dá)定位于淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞膜和胞質(zhì),呈棕黃色。LMVD結(jié)果的判定參考Weidner的方法[3]。根據(jù)D2-40染色以陽性著色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇分別計(jì)為1個(gè)陽性微淋巴(LMVD )。先在40倍光學(xué)顯微鏡下確定5個(gè)著色密集的區(qū)域(即“hotspot”),200倍光學(xué)顯微鏡下分別計(jì)數(shù)5個(gè)視野,取其均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Paxillin、D2-40在正常胃黏膜組織和早期胃癌中表達(dá)的差異及與臨床病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn),Paxillion、D2-40表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法,P<0.05及P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件)。

2 結(jié)果

2.1 胃組織中Paxillin的表達(dá)及LMVD

根據(jù)Speiser的判定標(biāo)準(zhǔn):切片中陽性細(xì)胞數(shù)小于10% 為陰性片,大于10%為陽性片。Paxillion在76例早期胃癌和相應(yīng)正常胃黏膜中的陽性表達(dá)率分別為71.1%(54/76)和9.2%(7/76)。早期胃癌和相應(yīng)正常胃黏膜組織的LMVD的表達(dá)情況，見表1。

表1 早期胃癌和正常胃黏膜的Paxillin的表達(dá)及其LMVD比較

2.2 早期胃癌中D2-40標(biāo)記的LMVD的特點(diǎn)

正常胃黏膜組織中D2-40 陽性染色微淋巴管在黏膜固有層、黏膜下層、肌層及漿膜層均可見到,在黏膜下層數(shù)目最多,多呈擴(kuò)張狀,形態(tài)大小不一,壁較薄,其LMVD為(3.2±1.8)個(gè)/mm2；早期胃癌組織中也可見明顯的D2-40陽性染色微淋巴管,管內(nèi)未見RBC,少數(shù)微淋巴管內(nèi)可見淋巴細(xì)胞,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的早期癌中可在微淋巴管內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌栓,甚至在部分淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移的早期胃癌微淋巴管內(nèi)也發(fā)現(xiàn)癌栓。在早期胃癌組織中,腫瘤邊緣和中心均可見微淋巴管,但其分布和形態(tài)具有明顯的差異性。分布差異:腫瘤邊緣區(qū)微淋巴管數(shù)目少,其LMVD為(12.3 ±2.4)個(gè)/mm2,而腫瘤中心區(qū)微淋巴管數(shù)目多,其LMVD為(16.7±3.3)個(gè)/mm2(P<0.05)。據(jù)我們觀察腫瘤邊緣區(qū)和中心區(qū)微淋巴管均為管腔較大,為中空橢圓形呈擴(kuò)張的功能淋巴管,兩者之間形態(tài)未見明顯差異。Paxillin蛋白的陽性表達(dá)及D2-40染色所顯示LMVD在早期胃癌和相較于表達(dá)陰性者呈明顯增高現(xiàn)象(P<0.01),見表2。

表2 早期胃癌中Paxillion陽性表達(dá)與LMVD和臨床病理因素的關(guān)系比較(例，%)

2.3 早期胃癌Paxillin蛋白表達(dá)與D2-40標(biāo)示的LMVD的關(guān)系

Paxillin蛋白陽性患者的LMVD值為(21.3±2.6)個(gè)/mm2，而Paxillin陰性的早期胃癌患者的LMVD值為(8.4±2.4)個(gè)/mm2，兩者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=8.4627,P<0.05)。

3 討論

研究證明惡性腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移是其生物學(xué)本性之一，而腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移有著非常復(fù)雜的病理生理學(xué)因素，多種因素參與其中，正常組織細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)之間的粘附和脈管因素對其有重要影響[4,5]。通常認(rèn)為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移先是由于腫瘤細(xì)胞與基膜粘附性降低，進(jìn)而脫離基膜,在間質(zhì)中形成浸潤灶,再以粘附、溶解結(jié)締組織的方式穿破進(jìn)入血液或淋巴,隨血液或淋巴到達(dá)其他組織器官并再突破脈管基膜,在局部增殖形成轉(zhuǎn)移灶,因此腫瘤細(xì)胞粘附性的強(qiáng)弱和腫瘤間質(zhì)脈管的形成及其密度在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用[6]。

Paxillin是近年來發(fā)現(xiàn)的1種重要的細(xì)胞黏附因子,主要存在于黏著斑,而黏著斑是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 聯(lián)系的紐帶,可促進(jìn)信號從ECM 經(jīng)整合素途徑向細(xì)胞內(nèi)傳遞。Paxillin還是致瘤性酪氨酸激酶的1種底物,與整合素相關(guān)聯(lián),構(gòu)成細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)局部黏附關(guān)鍵部位,調(diào)節(jié)細(xì)胞的移動(dòng)和播散等功能,從而提高腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力[7,8]。本實(shí)驗(yàn)通過對Paxillin在早期胃癌和相應(yīng)正常胃黏膜中的表達(dá)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)早期胃癌的Paxillin病例陽性表達(dá)高于正常胃黏膜的陽性表達(dá)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),提示早期胃癌中Paxillin蛋白高表達(dá)有實(shí)際意義,目前還沒有合適的生物學(xué)指標(biāo)可以準(zhǔn)確地預(yù)測早期胃癌的發(fā)展和預(yù)后。Paxillin在早期胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中起重要作用,有可能成為判斷早期胃癌生物學(xué)行為的重要指標(biāo)。

在大多數(shù)實(shí)體腫瘤中,癌細(xì)胞通過淋巴管向局部淋巴結(jié)擴(kuò)散是轉(zhuǎn)移性疾病中1個(gè)重要的早期事件。腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移需要新脈管生成,腫瘤微脈管形成在許多臨床腫瘤中已被證實(shí)是1個(gè)判斷轉(zhuǎn)移、預(yù)測預(yù)后的新指標(biāo)。現(xiàn)在用于反映LMVD 的標(biāo)記物有多種,其中D2-40特異性最強(qiáng)[9]。目前以D2-40為標(biāo)記來研究早期胃癌的LMVD 的報(bào)道尚不多見。本實(shí)驗(yàn)以D2-40 標(biāo)記正常胃組織及早期胃癌組織中的LMVD,結(jié)果表明,早期胃癌中心區(qū)和周邊區(qū)均見明顯增多的淋巴管，而且管腔擴(kuò)張的有功能的淋巴管和管腔閉鎖的無功能的淋巴管未見有明顯區(qū)別，這種結(jié)果與孫薇等[10]的研究結(jié)果相沖突。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：早期胃癌組織中LMVD 明顯高于正常胃組織,有胃漿膜外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者LMVD 明顯高于無轉(zhuǎn)移者 (P均<0.05)，這提示淋巴管的生成與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過淋巴管轉(zhuǎn)移至引流區(qū)淋巴結(jié)可能是一些腫瘤初始轉(zhuǎn)移階段最主要的途徑,癌細(xì)胞以“離散”方式存在于淋巴管內(nèi),能動(dòng)性增加,侵襲性增強(qiáng),易于突破基膜,向周圍組織浸潤,并穿過淋巴管,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。提示高LMVD可能是早期胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過D2-40檢測的LMVD可以作為預(yù)測早期胃癌患者淋巴轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。

總之，Paxillin和D2-40在早期胃癌中高表達(dá)，而且腫瘤組織分化越低，Paxillin表達(dá)越強(qiáng)，D2-40標(biāo)記的淋巴管生成量越多，從而可以推測淋巴結(jié)越有轉(zhuǎn)移的可能，雖然不能說明二者有直接關(guān)系，但可以推測Paxillin和D2-40可以成為預(yù)測早期胃癌轉(zhuǎn)移與預(yù)后的重要指標(biāo)。

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