P57KIP2和SKP2在卵巢黏液性腫瘤組織中的表達及臨床意義

楊 娟 肖 蘭

P57KIP2蛋白是1種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)，屬CIP/KIP家族，在細胞周期中起負調控作用，能抑制細胞從 G1期到 S期的轉化，進而阻止細胞的增殖，被認為具有抑癌基因活性。而SKP2既S期激酶相關蛋白2，是SCF復合物的成員之一，能特異性識別底物并與之結合,使之進入泛素化蛋白酶體降解途徑。有關在腫瘤發生發展中SKP2與P57KIP2表達的相關性，目前國內外少有報道。我們采用免疫組化SP法，檢測P57KIP2、SKP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中的表達，比較其表達與卵巢黏液性腫瘤臨床病理特征的關系，并探討卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中P57KIP2與SKP2表達的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

本組標本均取自孝感市中心醫院2009年1月～2012年1月手術切除的標本。卵巢黏液腺癌47例,年齡42～76歲，平均年齡61歲；卵巢黏液性交界性腫瘤12例(不包括交界性腫瘤伴微小浸潤)，均經充分取材，未見黏液腺癌成分，年齡39～68歲，平均年齡56歲；卵巢良性黏液性囊腺瘤12例，經充分取材，確認為良性，年齡40～58歲，平均年齡45歲。卵巢黏液腺癌：高分化11例，中分化26例，低分化10例；TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期共36例，Ⅲ期、Ⅳ期共11例；有淋巴結轉移者10例，無淋巴結轉移者37例。

1.2 試劑

即用型單克隆抗體鼠抗人P57KIP2購自福州邁新公司,即用型單克隆抗體鼠抗人SKP2、通用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化SP法,具體步驟按說明書進行。以PBS液代替一抗作為陰性對照。P57KIP2陽性染色位于細胞核或細胞質內,以細胞核染色為主；SKP2陽性染色位于細胞核內，均為黃色或棕黃色顆粒，本組切片均無胞核與胞質同時表達的現象。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機計數1000個腫瘤細胞,根據陽性細胞數占腫瘤細胞總數的百分比計分:①陽性細胞數<5%為陰性(-);②5%～24%為弱陽性(+);③ 25%～49%為陽性(++);④≥50%為強陽性(+++) 。

1.4 統計學處理

應用SPSS11.0軟件，采用四格表資料的χ2檢驗、行×列資料的χ2檢驗(校正)及Pearson相關分析進行統計。

2 結果

2.1 P57KIP2、SKP2蛋白在卵巢各黏液性腫瘤組織中的表達情況

表1 P57KIP2、SKP2蛋白在卵巢各黏液性腫瘤組織中的表達情況(例)

a為良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤比較；b為黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌比較；c為良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌比較

由表1可見，卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌組織中P57KIP2陽性表達率分別為100.0%、91.7%、44.7%，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤其陽性表達率比較無統計學差異(P>0.05)，而黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌、良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌比較均具有統計學差異(P<0.05)；卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中SKP2陽性表達率分別為0、16.7%、36.2%，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤、黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌比較無統計學差異(P>0.05)，而良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌其陽性表達率比較具有統計學差異(P<0.05)。

2.2 P57KIP2、SKP2蛋白表達與卵巢黏液腺癌臨床病理特征的關系

P57KIP2、SKP2表達與卵巢黏液腺癌患者年齡、淋巴結轉移無相關性(P> 0.05)，與卵巢黏液腺癌組織學分化及TNM分期相關(P< 0.05)，在高、中、低分化卵巢黏液腺癌中P57KIP2陽性表達率依次下降，而SKP2陽性表達率依次升高，見表2。

表2 P57KIP2、SKP2蛋白表達與卵巢黏液腺癌臨床病理特征的關系(例)

2.3 P57KIP2、SKP2蛋白在胞質中的表達與淋巴結轉移的關系

10例有淋巴結轉移中，P57KIP2胞質陽性表達4例，陽性率為40.0%(4/10)，37例無淋巴結轉移中，P57KIP2胞質陽性表達3例，陽性率為8.1%(3/37)，兩者比較差異有統計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移病例中SKP2胞質陽性表達1例，陽性率為10.0%(1/10)，無淋巴結轉移病例中，其胞質陽性表達6例，陽性率為16.2%(6/37)，兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 卵巢黏液腺癌組織中P57KIP2與SKP2表達的相關性

表3 卵巢黏液腺癌組織中P57KIP2與SKP2表達的相關性(細胞核表達)(例)

由表3可見，卵巢黏液腺癌中P57KIP2蛋白和SKP2蛋白同時陽性表達有4例(4/21),P57KIP2蛋白和SKP2蛋白同時陰性表達有13例(13/26) ，經Pearson相關分析兩者呈負相關性(γ=-0.292,P=0.046<0.05)。

3 討論

研究表明P57KIP2蛋白通過與Cyclin-CDK復合物結合而抑制CDK活性，P57KIP2 蛋白主要抑制CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2等G1期和S期激酶復合物,使細胞不能通過 G1期[1]，從而抑制細胞的增殖 ，起到腫瘤抑制基因的效應。本研究結果顯示P57KIP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中陽性表達率依次降低，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤其陽性表達率比較無統計學差異，而兩者與黏液腺癌陽性表達率比較均有統計學差異。在黏液腺癌中，P57KIP2表達與患者年齡、淋巴結轉移無關，其低表達與腫瘤分化低及TNM分期晚有關，另外，本研究結果顯示有淋巴結轉移黏液腺癌P57KIP2胞質陽性表達率較無淋巴結轉移黏液腺癌明顯升高，差異具有統計學意義。有學者提出P27KIP1蛋白在胞質中表達與CyclinD1和CyclinD3過表達顯著相關,并發現P27KIP1突變后(CyclinD結合位點的丟失)，則在核中的表達增強[2]。由于P57KIP2與P27KIP1是密切相關的2種CDKI，同屬CIP/KIP家族，在結構上也具有一定的同源性，因此推測在細胞惡變的過程中，細胞核中的CyclinD出現過表達，P57KIP2在細胞核中合成后與CyclinD-CDK4結合并被移致胞質，導致胞質中P57KIP2表達水平升高而胞核中P57KIP2表達水平下降。

本研究結果顯示，SKP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中陽性表達率依次升高，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤、黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌中SKP2陽性表達率比較無統計學差異，而良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌中其陽性表達率具有統計學差異，在黏液腺癌中SKP2表達與患者年齡、淋巴結轉移無關，而其高表達與腫瘤分化低及TNM分期晚有關，有淋巴結轉移黏液腺癌SKP2胞質陽性表達率較無淋巴結轉移黏液腺癌有所降低，但差異無統計學意義。這些結果表明了SKP2高表達與黏液腺癌的發生發展相關。虞志強[3]研究結果發現大腸癌中SKP2陽性表達率與脈管內癌栓、淋巴結轉移率呈正相關,顯示SKP2在大腸癌中表達水平與組織分化程度和TNM分期有關,在低分化大腸癌中呈高表達,且其表達水平在高、中、低分化癌組織中存在顯著性差異,說明SKP2蛋白過表達與大腸癌發生和發展相關。這些結果都表明，SKP2在細胞分化過程中發揮重要作用,因此,SKP2可能作為判斷惡性腫瘤惡性程度的輔助指標。

P57KIP2和P27KIP1是2種密切相關的CDKI，同屬于CIP/KIP家族，兩者的N-末端有40%的同源性，而C-末端均有核觸發區域，其中含有磷酸化位點，P57KIP2的磷酸化位點是310位蘇氨酸,P27KIP1的磷酸化位點是187位蘇氨酸。cyclinE-CDK2促使P27KIP1的187位蘇氨酸磷酸化，磷酸化后的P27KIP1能被SKP2識別而進入泛素蛋白酶體途徑被降解[4]，本研究旨在探討磷酸化后的P57KIP2是否也能被SKP2識別而進入泛素蛋白酶體途徑被降解。本研究結果經Pearson相關分析顯示P57KIP2表達與SKP2表達呈負相關，從而初步推測在卵巢粘液性腺癌發生發展的過程中，SKP2參與了P57KIP2的降解，這與Kamura[5]的研究結果基本一致。目前有研究表明，SKP2是在G1期向S期轉換的過程中降解P57KIP2，而在G0/G1過度期也可以觀察到P57KIP2的降解，至于P57KIP2在G0/G1過度期的降解機制目前仍不清楚，需要進一步探討。

所以，在卵巢黏液腺癌發生發展的過程中P57KIP2表達水平下降的原因推測如下：① 在卵巢組織惡變的過程中，細胞核中的cyclinE-CDK2復合物的活性增強，使P57KIP2磷酸化而被SKP2識別并進入泛素蛋白酶體途徑被降解；②在細胞惡變的過程中，細胞核中CyclinD出現過表達，P57KIP2在細胞核中合成后與CyclinD-CDK4結合并被移致胞質，導致細胞核中P57KIP2的表達水平下降；③在卵巢組織惡變的過程中，P57KIP2基因組出現了基因印記缺失或印記錯誤導致了基因表達水平下降。細胞核中P57KIP2表達水平下降，使P57KIP2對CyclinE-CDK2 、CyclinA-CDK2的結合抑制作用及對PCNA的結合抑制作用減弱，從而減弱了對細胞周期的抑制作用，又進一步促進卵巢組織的惡變。

綜上所述,P57KIP2、SKP2的異常表達與卵巢黏液腺癌的發生、發展密切相關,P57KIP2抑制卵巢黏液腺癌的發生發展，而SKP2促進其發生發展。P57KIP2、SKP2蛋白的檢測可為判斷卵巢黏液腺癌的惡性程度提供重要參考。目前，國內外關于SKP2與P27KIP1的相關性的研究較多，但對于SKP2與P57KIP2的相關性的研究較少，本研究初步證實了在卵巢組織惡變的過程中SKP2參與了P57KIP2的降解。關于P57KIP2和SKP2的表達及兩者相關性的進一步闡述,將有助于揭示卵巢黏液腺癌的發生機制并為臨床治療提供指導意義。

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[2] Gustavo B,Barbara B,Paola B,et al.Overexpressed cyclinD3 contributes to retaining the growth inhibitor p27 in the cytoplasm of thyroid tumor cells〔J〕.J Clin Invest,1999,104(7):865.

[3] 虞志強.SKP2蛋白在直腸癌及其遠端切緣組織中表達的臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志，2009，5(24):471.

[4] Tsvetkov LM,Yeh KH,Lee SJ,et al.p27kip1 ubiquitination and degradation is regulated by the SCFSKP2 complex through phosphorylated Thr187 in p27〔J〕.Curr Biol,1999,9:661.

[5] Kamura T,Hara T,Kotoshiba S,et al.Degradation of p57(K-IP2) mediated by SCFSKP2-dependent ubiquitylation〔J〕.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(18):10231.