雌激素受體亞型α、β在乳腺癌中的表達及其臨床意義

胡鳳娣 鄒天寧 鄧明佳 李 科 沈麗達

雌激素在乳腺癌發生發展中起著至關重要的作用，它通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)α和β(ERα和ERβ)結合形成復合物后，轉移至細胞核內，刺激細胞核DNA啟動蛋白合成、細胞生長和增殖[1]。ERα和ERβ在人體組織內分布不一，與配體結合的特性不同，提示它們可能具有不同的生物學作用[2]。我們通過半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測乳腺癌組織、癌旁組織、癌周正常組織的ERα、ERβ mRNA的表達，探討其在乳腺癌發生、發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

所有標本系云南省腫瘤醫院乳腺中心手術切除，各標本組織類型均經病理檢查證實，共45例，均為女性，年齡35～73歲，中位年齡47歲。每例患者均取癌組織、相應癌旁組織(距癌灶1～ 2 cm)、相應正常腺體(距癌灶>7 cm)。全部組織標本獲取前均未經化療和(或)放療及內分泌治療。標本取材后迅速投入液氮中速凍，然后放入-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 用TRIzol一步法提取總RNA，DEPC水溶解RNA，電泳檢測RNA完整性，紫外分光光度計測定260 nm和280 nm吸光度，計算出RNA的濃度和純度。

1.2.2 RT-PCR 擴增 取500 ng總RNA，采用One-step RT-PCR 試劑盒(BD公司)，對ERα、ERβ和β-actin mRNA進行RT-PCR擴增。擴增ERα上游引物為：5'-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3'，下游引物為：5'-CAACCGTCGAGAGTACAGAGG-3'，產物片段長263 bp；擴增ERβ上游引物為：5'-AGTGCGGCTCTTGGAGAGCTG-3'，下游引物為：5'-AGACCAGTGTCGTGGGTCC-3'，產物片段長472 bp；擴增β-action上游引物為5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3',下游產物為5'-AGCACTGTG TTGGCGTACAG-3',產物長301 bp。反應參數設置如下：50 ℃逆轉錄60 min，94 ℃ 5 min滅活逆轉錄酶，然后進行35個周期PCR擴增反應，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min，最后68 ℃延伸2 min。ERα、ERβ和β-actin反應條件相同。

1.2.3 RT-PCR產物的半定量分析 RT-PCR 擴增后，取5 μl PCR 產物,加少量溴乙啶染色,進行瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠成像儀掃描成像。RT-PCR 產物的定量分析，以條帶的大小及深淺判斷ERα、ERβ和β-actin產物量，并經圖像分析處理。以平均光密度×條帶面積，表示總光密度,以此代表mRNA 的量。各組織中β-actin表達穩定，故用ERα、ERβ與β-actin產物帶吸光度的比值表示組織標本ERα、ERβ相對表達水平。

1.2.4 測序分析 將ERα、ER β產物凝膠回收，測序由寶生物公司完成。

1.3 統計學方法

數據處理采用SPSS17.0軟件包。不同組織中ERα相對表達值為非正態分布，采用秩和檢驗,并對ERα和ERβ在乳腺癌組織中的表達水平與年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期之間的關系進行分析，P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ERα mRNA的表達

ERα mRNA在45例癌組織中28例表達，全矩0～0.86，中位數0.55；癌旁組織24例表達，全矩0～0.82，中位數0.54；正常乳腺組織19例表達，全矩0～0.76，中位數0.43。表達為非正態分布，經秩和檢驗,ERα在癌組織、癌旁組織、正常組織中表達差異無統計學意義(P>0.05)，但從正常組織、癌旁組織到癌組織有增高趨勢。

2.2 ERβ mRNA的表達

ERβ mRNA在45例癌組織中21例表達，全矩0～0.77，中位數0.44；相應癌旁組織32例表達，全矩0～0.90，中位數0.56；相應正常乳腺組織34例表達，全矩0～1.14，中位數0.65。乳腺癌組織與相應癌旁組織、正常乳腺組織之間ERβ mRNA表達差異有統計學意義，P<0.05。乳腺癌組織中ERα、β mRNA的表達(圖1)。

圖1 乳腺癌組織中ERα、ERβ的表達

2.3 ERα、ERβ mRNA的表達與乳腺癌臨床病理的關系

ERα mRNA表達與年齡、原發腫瘤大小、TNM分期無關 (P>0.05)，而與淋巴結轉移狀況有關(P<0.05)；ERβ mRNA表達與年齡無關(P>0.05)，而與原發腫瘤大小、TNM分期、淋巴結轉移狀況有關(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織ERα、ERβ表達的中位數與臨床特征的關系

3 討論

雌激素受體不僅是乳腺癌重要的預后指標之一，也是乳腺癌內分泌治療的重要靶點。ER有2種亞型:

一種為傳統的ERα,另一種為后來研究發現的ERβ。臨床所進行的ER檢測主要是對ERα的檢測。ERβ的出現使人們重新評估雌激素受體的生物學功能及其在乳腺腫瘤發生、發展及耐藥機理方面的意義。ERβ與ERα有高度同源性，但ERα基因位于染色體6q24區段，而ERβ基因則位于14q22～24區段，兩者的結構差異決定了其功能的差異[3]。另外，ERα和ERβ組織分布不一，與配體結合特性不同，提示它們可能具有不同的生物學作用[2]。

本研究對45例正常乳腺組織檢測結果顯示，ERα與ERβ均有表達，并且ERβ表達顯著高于ERα,提示ERβ的表達可能在正常乳腺細胞中發揮更重要的作用，ERβ可能是正常乳腺的優勢雌激素受體。多數研究[4，5]表明,ERβ對正常乳腺組織具有保護作用,可對抗ERα的促腫瘤生長作用,誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，其表達缺失可能對乳腺癌的發生、發展具有極其重要的意義。

本實驗對癌組織、癌旁組織及正常乳腺組織中ERα檢測，比較其基因表達水平的差異，結果雖然沒有統計學意義，但可以看出在癌變過程中ERα的表達呈上升趨勢。ERβ在癌組織中表達明顯低于正常組織，提示ERβ的缺失會降低其對乳腺的保護作用，引起癌變。本研究中ERα陽性組，ERβmRNA表達低于陰性組，提示ERα與ERβ在腫瘤發生過程中存在著相互作用，ERαmRNA表達可能下調ERβmRNA。ERα的上調與ERβ的下調，協同輔助因子表達失衡，可能直接或間接造成乳腺細胞的信號傳導紊亂，使細胞增生更活躍，修復不完全，最終導致細胞惡變。Williams等[6]通過構建可誘導表達ERβ的T47D細胞系，對該細胞中35 000個基因的mRNA基因組表達譜進行檢測,結果發現，ERβ激活后可抑制ERα對其靶基因的調節作用,并可改變某些ERβ特異性靶基因的表達。

目前對ERα在乳腺癌中的作用已進行了較多研究,并已達成共識,而對ERβ在乳腺癌中的作用還存在較大爭議。本研究發現癌組織中ERβ表達與患者年齡無關，與腫瘤大小、病理分期、淋巴結轉移有關。ERβ在癌變過程中表達逐漸降低，且與腫瘤大小、淋巴結轉移狀況負相關的表達，證明ERβ可能是1種保護性的雌激素受體，ERβ陽性腫瘤侵襲性低。近來,越來越多的研究表明ERβ可能作為乳腺癌新的預后指標[7],但它與乳腺癌的發展及預后關系,各家報道并不一致。Vesna 等[8]發現,在腫瘤體積大于20 mm的病例中,ERβ1和ERβ5的表達顯著降低,表明在腫瘤發展過程中ERβ的轉錄下調。這一發現與ERβ為抑癌基因的假說吻合。Zhao等[9]對HEK293乳腺癌細胞系研究表明，ERβ2能夠抑制ERα的表達,從而解釋ERβ2總是伴隨ERα陰性表型的現象,該研究證實了ERβ2對ERα介導的乳腺癌發展的影響作用。但近期一項283例浸潤性乳腺癌的研究表明腫瘤分期較高的病例中胞質ERβ水平較高[10]。

ERβ的發現和研究為乳腺癌患者(尤其為ER陰性乳腺癌患者)的內分泌治療研究提供了新的視角。對于ERα陽性的乳腺癌患者，應給予雌激素受體拮抗劑治療，有研究表明，即使ER、PR均陽性的乳腺癌患者，也有約1/3對內分泌治療抵抗，部分乳腺癌細胞甚至被他莫昔芬刺激生長[11]。既往有研究表明在ERα陰性的乳腺癌中給予雌激素受體拮抗劑他莫昔芬治療后，ERβ陽性組較陰性組臨床預后好，差異具有統計學意義[12，13]。ERβ信號通道能否成為ERα陰性乳腺癌患者的內分泌靶向治療目標，尚需進一步研究。本研究為進一步探索ERβ在乳腺中的正常生理作用，以及為乳腺癌的發生和生存預后分析提供了臨床研究依據,而進一步研究也可能為乳腺癌內分泌藥物研發提供新的治療靶點,為預后判斷及指導治療提供臨床依據。

[1] Thomas C,Gustafsson,J A.The different roles of ER subtypes in cancer biology and therapy〔J〕.Nature Reviews Cancer,2011,11(8):597.

[2] Zwart W,de Leeuw R,Rondaij M,et al.The hinge region of the human estrogen receptor determines functional synergy between AF-1 and AF-2 in the quantitative response to estradiol and tamoxifen〔J〕.Journal of Cell Science，2010,123(Pt8):1253.

[3] Mosselman S,Polman J,Dijkema R.ER beta：identification and characterization of a novel human estrogen receptor〔J〕.FEBS Lett,1996,392(1):49.

[4] Grober OM,Mutarelli M,Giurato G,et al.Global analysis of estrogen receptor beta binding to breast cancer cell genome reveals an extensive interplay with estrogen receptor alpha for target gene regulation〔J〕.BMC Genomics,2011,14(12):36.

[5] Chen L,Qiu J,Yang C,et al.Identification of a novel estrogen recept or beta1 binding partner,inhibitor of differentiation-1,and role of ERbeta1 in human breast cancer cells〔J〕.Cancer Lett,2009,278(2) ：210.

[6] Williams C,Edvardsson K,Lewandowski S A,et al.A genome-wide study of the repressive effects of estrogen receptor beta on estrogen receptor alpha signaling in breast cancer cells〔J〕.Oncogene,2008,27 (7):1019.

[7] 馮 雯,張計訓,盛 霞.雌激素受體β在乳腺癌中的表達〔J〕.中國臨床醫學,2009,16(3) ：476.

[8] Vesna M,Dragica N V,Nikola T,et al.Expression of estrogen receptor β isoform (ERβ1) and ERβ5 splice variant mRNAs in sporadic breast cancer〔J〕.Cancer Res Clin Oncol,2007,133(8)：571.

[9] Zhao C,Matthews J,Tujague M.Estrogen receptor β 2 negatively regulates the transactivation of estrogen receptor alpha in human breast cancer cells〔J〕.Cancer Res,2007,67(8) ：3955.

[10] Bates GJ,Fox SB,Han C,et al.Expression of the fork head transcription factor FOXP1 is associated with that of estrogen receptor β in primary invasive breast carcinomas〔J〕.Breast Cancer Res Treat，2008,111(3)：453.

[11] W Zwart A，Griekspoor M，Rondaij D,et al.Classification of anti-estrogens according to intramolecular FRET effects on phospho-mutants of estrogen receptor α〔J〕.Molecular Cancer Therapeutics，2007,6 (5)：1526.

[12] Esslimani-Sahla M，Simony-Lafoniaine J，Kramar A,et al.Estrogen receptor beta(ERbeta) level but not its ERbetaex variant helps to predict tamoxifen resistance in breast cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2004，10(17):5769.

[13] Gruvberger- Saal SK,Bendahl PO,Saal LH,et al.Estrogen receptor beta expression is associated with tamoxifen response in ER-alpha negative breast carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2007，13(7):1987.