宮頸癌中cIAP1與Dab2的基因改變

鄭曉娟 胡新榮 唐澤立 李飛虹 黃 冰 龐天云

宮頸癌的全球發病率居第二位，在我國，則是婦科惡性腫瘤的第一位死亡原因。宮頸癌起源于正常宮頸上皮，進而發展為宮頸上皮內瘤變(CIN)，再經過幾年或十幾年可發展為浸潤癌[1,2]。CIN中10%～20%的病例進展為浸潤癌，其余可長期存在或自行消退[1,2]。尋找與宮頸癌發生發展有關的分子標志，進而尋找CIN進展的分子標志是區分具有不同生物學特性的宮頸上皮內腫瘤和早期提示、診斷宮頸癌的關鍵。在宮頸腫瘤中常見的染色體擴增區域的基因位于11q22的cIAP1、5p13的Dab2等。cIAP1是1個凋亡抑制基因，在宮頸腫瘤中的表達增加[3]。Dab2為分裂原反應性磷酸化蛋白基因。癌基因cIAP1和抑癌基因Dab2均是新近被注意的，相關報道還很少，在宮頸腫瘤中的基因型還未明確。本實驗應用PCR技術對宮頸癌及癌旁正常組織中cIAP1及Dab2進行初步檢測，以期發現與宮頸癌發生發展相關的分子標志。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究病例資料取自廣東醫學院附屬醫院婦產科，為2004年～2006年間手術切除的41例新鮮宮頸癌標本。新鮮組織自患者體內取出后，立即送病理科由經驗豐富的病理科醫師取材，取材內容包括宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織，并裝入凍存管中，置于-80℃冰箱密封保存備用。切片時置于-20℃冰凍切片機中，6～8 μm連續切片，切片亦置于-80℃低溫冰箱中保存備用。

1.2 試劑與儀器

微量DNA提取試劑盒，購自廣州齊特科生物工程有限公司。cIAP1、Dab2的引物，自行設計，由上海生物工程技術有限公司合成。瓊脂糖凝膠，購自廣州威佳科技有限公司。50bp DNA ladder，購自北京天為時代。溴化乙錠(EB)。

實驗所用引物B-globin (產物長度：102bp)：S 5'-gTg CAT CTg ACT CCT gAg gAg A-3'；A 5'-CCT TgA TAC CAA CCT gCC CAg-3'。GAPDH(產物長度：231bp)：S 5'-ACg gAT TTg gTC gTA TTg gg-3'；A 5'-TCA TTT Tgg Agg gAT CTC gC-3'。cIAP1(產物長度：245bp)；S 5'-TCC CAg gTC CCT CgT ATC AA-3'；A 5'-ATC CAg CAT CAg gCC ACA AC-3'。Dab2(產物長度：425bp)：S 5'-TTC CCT ACT gAA CCC TAC CT-3'；A 5'-ATg AAT AAT gTT CTT CCC TC-3'。

儀器有倒置顯微鏡；臺式離心機；752型紫外分光光度計；PCR擴增儀；穩壓穩流電泳儀；紫外透射分析儀。

1.3 方法

選取正常宮頸組織和宮頸癌這兩個起始端和終端，檢測cIAP1,Dab2。將蘇木精輕染的宮頸癌切片置于倒置顯微鏡載物臺上，10倍鏡下手持清潔手術刀片在需要切割的區域來回刻劃，用刀片蘸取少量裂解液，粘取游離的細胞，將其轉移到裝有200 μl裂解液的凍存管中，細胞大約蓋滿管底即可，然后使用微量DNA提取試劑盒提取制備DNA。將每一例樣本的正常宮頸組織和癌組織進行配對，測定所提取宮頸癌組織及癌旁正常組織DNA的OD值，在25 μl的PCR反應體系中，均統一加入0.8 μg模板DNA。在同一批次分別針對待檢基因和相應的看家基因做PCR，電泳時在同一個加樣孔中分別加入2種產物各8 μl，待電泳結束后，對凝膠進行染色。按照同樣的方法對每個基因均重復檢測2次。顯微切割圖片見圖1，圖2。

1.4 電泳圖像分析及統計學處理

運用bandscan4.3對電泳圖像中的各個泳帶進行灰度掃描，取2次實驗灰度值的均值。計算出待檢基因擴增產物灰度值與相應看家基因擴增產物灰度值的比值，以這一比值作為校正值(相對灰度)，運用SPSS13.0進行統計學分析，采用配對樣本t檢驗處理數據，檢驗水準α=0.05，根據處理結果確定基因的擴增或丟失情況。

圖1 宮頸癌冰凍切片顯微切割癌巢前(100×)

圖2 宮頸癌冰凍切片顯微切割癌巢后(100×)

2 結果

2.1 cIAP1在宮頸癌中的拷貝數改變

cIAP1在宮頸癌組織中相對灰度的均值為0.716，在正常宮頸組織中相對灰度的均值為0.550，兩者經配對樣本t檢驗，t=-3.205，P(雙)=0.006，差異有統計學意義。

2.2 Dab2在宮頸癌中的拷貝數改變

Dab2在宮頸癌組織中相對灰度的均值為0.235，在正常宮頸組織中相對灰度的均值為0.189，兩者經配對樣本t檢驗，t=-2.519，P(雙)=0.026，差異有統計學意義。

2.3 cIAP1、Dab2擴增情況

宮頸癌組織中cIAP1、Dab2均有不同程度的擴增。

以下電泳圖中相鄰兩泳道為同一例樣本，奇數泳道為正常組織，偶數泳道為癌組織，"M"為50 bp DNA ladder，見圖3，圖4。

圖3 宮頸癌與癌旁正常宮頸組織中cIAP1的基因擴增情況

圖4 宮頸癌與癌旁正常宮頸組織中Dab2的基因擴增情況

3 討論

宮頸癌的病因已很明確，即HPV感染，但其發生發展是1個多因素、多步驟、多基因調控的長期過程。許多研究表明宮頸癌的發生發展與抑癌基因的失活和癌基因的活化有關，其中研究較多并得到普遍認可的有P16等基因。P16INK4a、P14ARF基因在宮頸上皮內瘤變及宮頸鱗癌組織中高表達，有較高的特異性和敏感性，被認為是宮頸癌前病變及宮頸癌的診斷指標[4]。本文研究的cIAP1和Dab2是位于宮頸腫瘤中常見染色體擴增區域的2個基因，與宮頸癌發生發展的關系，在此做一總結。

凋亡抑制蛋白(IAP)家族是Crook等于1993年首次在桿狀病毒CpGV和OPMNPV中發現的[5]，它是目前發現的惟一可以和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)直接結合而起抑制作用的蛋白家族，其抗凋亡功能遠強于bcl-2家族，至今已發現8個人類IAPs家族成員，cIAP1是該家族成員之一，它們在抑制細胞凋亡的過程中起著重要的作用[6,7]。Kempkensteffen等[8]研究發現，cIAP1的過表達發生在大多數的腎細胞癌中，其表達升高對腎細胞癌具有診斷價值。目前在cIAP1與宮頸癌的關系方面的研究還比較少。Imoto等[3,9]先是發現了cIAP1在來自食管鱗癌細胞株的11q22上的擴增，因11q22上的擴增與多種腫瘤相關，之后又研究了11q22上的擴增與宮頸癌的放射抵抗的關系，發現在9個宮頸癌細胞株中，有2個細胞株顯示了cIAP1的擴增和與其相一致的過表達，同時與沒有cIAP1擴增的細胞株相比，也表現出了對由輻射誘發的細胞死亡的有效抵抗。這些都說明cIAP1的擴增在這種疾病的進展中可能起了非常重要的作用。cIAP1在宮頸腫瘤中是否過量表達，起何種作用，值得進一步研究。

本實驗結果顯示，宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中cIAP1的拷貝數有差別，癌組織較正常組織擴增產物的拷貝數明顯增加，兩者相比有統計學意義。目前有關cIAP1與宮頸腫瘤相互關系的報道寥寥可數，說明這一基因在宮頸腫瘤中有著很大的研究空間。

Dab2位于5p13，這是宮頸腫瘤中常見的基因擴增位點。Dab2在卵巢癌、前列腺癌等惡性腫瘤中表現為抑癌基因[10]。有研究報道，用RNA指紋方法在上皮癌中發現Dab2有不同程度的缺失[11]。卵巢癌和乳腺癌的研究發現大約80%的患者Dab2蛋白缺失，其缺失與腫瘤的分級無關，與腫瘤的惡變有關。Anupam等[12]發現Dab2在食管鱗癌中的表達也是下降的，可能其在食管鱗癌中也是作為1種抑癌基因存在的。Martin等[13]用RT-PCR和shRNA干擾技術檢測人類正常乳腺組織和乳腺腫瘤標本中Dab2的表達情況，結果發現，與正常人類乳腺組織相比，乳腺腫瘤中Dab2的2種剪切形式p96和p67的表達均下降。乳腺上皮細胞中Dab2的表達下降將導致Ras/MAPK信號增加，這將有利于構成轉化生長因子β(TGFβ)的信號回路，使TGFβ亞型的表達增加，而TGFβ的表達增加將導致基本的EMT表型出現。這表明在腫瘤細胞中，由于Dab2的表達受到抑制，細胞發生轉移的傾向會增加。有學者對鼻咽癌中Dab2蛋白的表達進行了研究，發現Dab2在該腫瘤中過表達，從而導致腫瘤細胞生長率下降，貼壁依賴性集落形成下降35%，且抑制血清誘導的c-Fos表達。這一研究結果表明，Dab2的過表達可以導致多個信號途徑的改變，提示Dab2是多個受體介導的信號通路中的銜接分子[14]。有關Dab2與宮頸癌關系的報道很少，僅有文獻報道，采用微點陣比較基因組雜交(CGH)的方法，對宮頸癌前病變、宮頸癌以及宮頸癌細胞株中拷貝數的變化進行了廣泛的檢測，發現Dab2基因在一部分宮頸病變中表現為擴增[15]。所以，對于宮頸癌中Dab2的基因改變情況、蛋白表達情況，及其在宮頸癌發生發展過程中的作用需要繼續深入研究。

本實驗結果顯示，宮頸癌組織和癌旁正常宮頸組織中Dab2的拷貝數有差別，癌組織較正常組織擴增產物的拷貝數明顯增加，兩者相比有統計學意義。從中初步推斷Dab2在宮頸癌中表現為擴增；并可推測其蛋白在宮頸癌中亦為過量表達。但目前發現Dab2在卵巢等腫瘤中表現為缺失，表現出抑癌基因的特點。迄今對Dab2的研究尚未足夠深入，對其作為抑癌基因也尚未定論，只是在體外組織培養中發現Dab2基因轉染可抑制細胞生長，誘發細胞死亡，所以對Dab2在良惡性腫瘤中的表達值得進一步研究。本實驗中初步發現Dab2在宮頸癌中表現為擴增，其是否和p16的情況相仿，需要我們用后續可靠的實驗來驗證這個結果，并作出合理解釋。

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