茅蒼術葉片可培養內生細菌多樣性及其促生潛力

周佳宇，賈 永，王宏偉，戴傳超

(南京師范大學生命科學學院，江蘇省微生物與功能基因組學重點實驗室，江蘇省微生物資源產業化工程技術研究中心，南京 210023)

茅蒼術(Atractylodes lancea(Thunb.)DC.)為菊科蒼術屬多年生草本植物，其干燥根莖為著名藥材蒼術。江蘇省茅山地區為茅蒼術道地產區，由于近年來掠奪性的采挖，加之生境破壞嚴重，茅蒼術資源面臨瀕危和枯竭［1］。目前，茅蒼術藥材基本來自人工栽培，因此，研究影響茅蒼術活性成分積累和配比的因素對高質量茅蒼術藥材的栽培和生產至關重要［2］。一些植物內生菌與宿主植物長期共存、協同進化。茅蒼術體內高揮發油含量的特殊環境使其蘊含有獨特的內生菌資源，而內生菌也能夠影響茅蒼術的生長發育及其藥用活性成分的組成和積累［3］。一些內生真菌能夠促進茅蒼術組培苗的生長，增強其對環境的適應性，提高其成活率［4］。

由于茅蒼術葉片是揮發油合成的主要部位，且其中的內生細菌尚無相關研究，本文探究了茅蒼術葉片中可培養內生細菌的多樣性及其固氮、解磷、解鉀和產生長素的能力。通過本研究篩選得到一些具有植物促生潛力的茅蒼術內生細菌資源，初步揭示了內生細菌與茅蒼術之間的相互關系，為進一步將內生細菌回接茅蒼術植株，增加茅蒼術藥材的產量和藥理活性物質的積累提供了重要依據。

1 材料與方法

1.1 植物來源與內生細菌的分離

多年生茅蒼術植株100株來源于茅蒼術道地產區江蘇省茅山地區九龍藥材公司茅蒼術藥材種植園，移栽至南京師范大學植物園生長超過2a，長勢良好、無病蟲害。2011年秋季，隨機挑選20株花果期健康的茅蒼術植株并摘取其完整的中上部葉片，共20片。

茅蒼術葉片經自來水和雙蒸水分別清洗后，用70%乙醇消毒1 min，0.1%升汞消毒10 min，無菌水沖洗多次［4］，研磨后分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養基和Luria Bertani(LB)培養基上，同時也分別涂布最后一次洗滌液，作為葉片表面滅菌徹底的對照。涂布好的培養基于30℃培養，待有菌落形成時，依據菌落形態的差異，分別挑取不同的內生細菌單菌落，純化后于LB斜面上4℃保藏。主要依據的形態特征有:菌落大小、菌落形狀、菌落邊緣是否齊整、菌落顏色、菌落透明度、菌落光澤度以及菌落表面是否光滑、是否存在特殊結構。

1.2 茅蒼術內生細菌的多樣性分析

使用通用引物27F和1492R［5］，采用菌液PCR對分離得到的茅蒼術內生細菌進行16S rDNA片段的擴增。擴增后獲得大小在1500 bp左右的片段，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗合格后進行核糖體DNA擴增片段限制性內切酶分析(ARDRA)。

將一部分16S rDNA片段擴增產物使用限制性內切酶HaeⅢ和AluⅠ在37℃下分別消化4 h，用3%瓊脂糖凝膠120 V電泳后紫外成像并拍照。使用GelcomparⅡ軟件［6］對獲得的限制性片段多態性圖譜進行UPGMA 聚類分析［7］。

在各ARDRA聚類簇中挑選代表菌株，對其16S rDNA片段進行測序。序列測定委托北京六合華大基因科技股份有限公司進行，測序引物與擴增相同，PCR產物直接測通。測序結果在Genbank中進行BLAST同源性比對，推測其分類地位。

對主要ARDRA聚類簇中的內生細菌進行BOX-PCR分析。BOX-PCR產物經上述凝膠電泳、成像、拍照和聚類分析后，得到主要ARDRA聚類簇中內生細菌的聚類分析圖，研究聚類簇水平上內生細菌的多樣性［8］。BOX-PCR采用通用引物BOX A1R［9］，50 μL反應體系，擴增條件:94℃預變性5 min;94℃變性1 min，45℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35個循環;72℃延伸6 min。

1.3 茅蒼術內生細菌促生潛力的分析

1.3.1 內生細菌固氮能力的測定

能夠在Burk's無氮培養基上正常生長的內生細菌菌株具有固氮潛力［10］。提取具固氮潛力的內生細菌的總DNA，使用引物nifH-F和nifH-R［11］擴增其nifH基因，能夠獲得大小在450 bp左右條帶的內生細菌含有nifH基因［12］。并對其16S rDNA片段進行擴增、測序，在Genbank中進行BLAST同源性比對后，獲得相似菌株的序列，Clustal X多重比對后，使用Mega 5.0軟件，采用Neighbor-Joining法構建系統發生樹，對各固氮菌株的系統發生地位進行分析，Bootstrap 1000次檢驗各分支的置信值。

1.3.2 內生細菌解磷能力的測定

將內生細菌分別接種于National Botanical Research Institute Phosphate(NBRIP)培養基［13］和蒙金娜有機磷培養基［14］上后，通過觀察是否有溶磷圈的形成來確定其是否具有溶解無機磷或有機磷的能力。進一步通過鉬銻抗比色法定量測定細菌溶解無機磷或有機磷的能力［15］，同時測定菌液的pH值。

鉬銻抗比色法的具體步驟如下:將OD600調節一致的茅蒼術內生細菌懸液1 mL接種于35 mL NBRIP液體培養基或蒙金娜有機磷液體培養基中。30℃，220 r/min培養7 d后8000 r/min離心10 min，取1 mL上清液于50 mL容量瓶中，加入鉬銻抗混合顯色劑5 mL后加水定容至刻度，靜置30 min后，于660 nm測定吸光值。吸光值帶入磷酸二氫鉀標準曲線y=0.007x+0.026，R2=0.997即可計算得到發酵液中可溶性磷元素的含量［15］。每個樣品3次重復。

1.3.3 內生細菌解鉀能力的測定

內生細菌的解鉀能力使用添加鉀長石粉作為唯一鉀源的硅酸鹽培養基進行檢測。將內生細菌分別接種于硅酸鹽培養基上，于30℃培養10 d后觀察，能夠生長的菌株具有解鉀潛力［16］。每個樣品3次重復。

1.3.4 內生細菌產生長素能力的測定

將OD600調節一致的茅蒼術內生細菌懸液1 mL接種于含5 mmol/L L-色氨酸的25 mL LB培養基中。220 r/min，30℃，避光培養48 h后，8000 r/min離心10 min，取1 mL上清液與2 mL Salkowski試劑混勻后于黑暗處室溫溫育30 min，使用分光光度計于530 nm處檢測其吸光值，帶入吲哚乙酸標準曲線計算出菌株48 h的生長素產生量［17］。每個樣品3次重復。生長素標準曲線使用已知的吲哚乙酸濃度分別在0—60 μg/mL和60—300 μg/mL的標準溶液顯色后在530 nm處的吸光值分別進行擬合［18］。生長素標準曲線分別為y=0.002x－0.001，R2=0.997(0—60 μg/mL)和 y=0.003x－0.079，R2=0.999(60—300 μg/mL)。

1.4 數據及圖譜分析

使用Excel軟件計算各菌株測定指標不同重復的平均值和標準差，并繪制圖形。ARDRA和BOX-PCR指紋圖譜分析使用GelcomparⅡ軟件。系統發育樹的構建使用Mega 5.0軟件。

2 結果與分析

2.1 茅蒼術內生細菌的分離

依據單菌落形態的差異，從茅蒼術葉片中分離得到52株可培養內生細菌，其中7株在傳代培養過程中停止生長，不納入實驗范圍。對可正常傳代培養的45株內生細菌分別編號為ALEB 1B、ALEB 2A、ALEB 2B、ALEB 3A、ALEB 3B、ALEB 4A、ALEB 5A、ALEB 5B、ALEB 6B、ALEB 7A、ALEB 7B、ALEB 8、ALEB 10、ALEB 11、ALEB 13—ALEB 15、ALEB 19—ALEB 22、ALEB 24—ALEB 47。

2.2 茅蒼術內生細菌的多樣性分析2.2.1 內生細菌的ARDRA分析

45株茅蒼術內生細菌的限制性片段多態性圖譜經UPGMA聚類分析后，以60%的相似度為標準劃分為14個聚類簇(圖1)。各聚類簇中代表菌株的16S rDNA全序列測定結果經Genbank同源性比對后，確定其可能的分類學地位(表1)。

表1 茅蒼術葉片可培養內生細菌ARDRA聚類簇Table 1 ARDRA clusters of the culturable endophytic bacteria from the leaves of Atractylodes lancea

2.2.2 主要ARDRA聚類簇內的BOX-PCR分析

在ARDRA聚類簇水平上使用BOX-PCR獲得的指紋圖譜對茅蒼術內生細菌主要聚類簇6和9進行細分，并進行UPGMA聚類分析(圖2)。聚類簇6中的11株內生細菌中親緣關系最近的菌株ALEB 6B和ALEB 11及ALEB 7A和ALEB 7B的相似度為95%;聚類簇9中親緣關系最近的菌株ALEB 40和ALEB 43的相似度為92%。說明相同茅蒼術內生細菌ARDRA聚類簇中的菌株具有豐富的多樣性，應屬于同一屬的不同種或同一種的不同菌株。BOX-PCR指紋圖譜的分析結果也表明茅蒼術體內蘊藏著豐富的內生細菌資源。

2.3 茅蒼術內生細菌促生潛力的篩選

45株茅蒼術內生細菌中有10株能夠在Burk's無氮培養基上正常生長，表明其具有固氮潛力。分別有19株和15株內生細菌具有溶解無機磷和有機磷的能力。有24株茅蒼術內生細菌能夠在硅酸鹽培養基上正常生長，具有解鉀潛力。其中ALEB 5A、ALEB 13和ALEB 35同時具有固氮、溶解有機磷和解鉀的能力，ALEB 14和ALEB 47同時具有固氮、溶解無機磷和解鉀的能力，ALEB 11、ALEB 27、ALEB 29和ALEB 37同時具有溶解無機磷和有機磷的能力，但并沒有發現同時具有固氮、溶解無機磷和有機磷、解鉀和產生長素能力的內生細菌菌株。

圖1 茅蒼術內生細菌限制性內切酶酶切指紋圖譜聚類分析Fig.1 Fingerprints and dendrogram of 45 endophytic bacteria based on ARDRA

45株茅蒼術內生細菌中有43株具有生長素產生能力，其中ALEB 44產生長素的能力最強，在30℃，220 r/min培養48 h后的生長素產生量達到(268.44±10.12)μg/mL。有25株內生細菌的生長素產生量高于 100 μg/mL。

2.4 茅蒼術內生固氮細菌nifH基因的擴增與16S r DNA的序列測定

2.4.1 茅蒼術內生固氮細菌nifH基因的擴增

對茅蒼術內生固氮細菌的nifH基因片段進行擴增后，ALEB 5A、ALEB 5B、ALEB 13、ALEB 14、ALEB 26、ALEB 35、ALEB 39、ALEB41和ALEB 47能夠獲得大小在450 bp左右的目的條帶，表明這9株內生細菌中含有nifH基因［11］。而ALEB 33在450 bp處并沒有條帶，其可能通過其它途徑獲得生長所需的氮元素。結合ARDRA聚類分析的結果，有近1/2的聚類簇中包含有具固氮潛力的茅蒼術內生細菌，其中ALEB 26屬于聚類簇1，ALEB 47屬于聚類簇3，ALEB 14屬于聚類簇4，ALEB 5A、ALEB 5B和ALEB 13屬于聚類簇5，ALEB 35屬于聚類簇8，ALEB 33和ALEB 39屬于聚類簇9，ALEB 41屬于聚類簇10。

圖2 聚類簇6和聚類簇9中內生細菌BOX-PCR指紋圖譜聚類分析Fig.2 Fingerprints and dendrogram of endophytic bacteria from ARDRA cluster 6 and 9 based on BOX-PCR

表2 茅蒼術內生細菌促生潛力的篩選Table 2 Plant growth-promoting potential of endophytic bacteria

續表

2.4.2 茅蒼術內生固氮細菌16S rDNA序列的測定及系統發育樹的構建

以10株具固氮潛力的茅蒼術內生細菌16S rDNA基因為基礎構建的系統發育樹(圖4)表明ALEB 5A、ALEB 5B和ALEB 13與土壤桿菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 14和ALEB 26與泛菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 33、ALEB 39和ALEB 41與假單胞菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 35與芽孢桿菌屬的典型菌株聚在相同位置，ALEB 47與短小桿菌屬的典型菌株聚在相同位置。

2.5 茅蒼術內生細菌溶解無機磷的定量檢測及細菌發酵液pH值的測定

結合菌液中可溶性磷元素的含量和pH值進行分析(圖5)。ALEB 43發酵液中可溶性磷元素的含量最高，達(251.43±4.16)mg/L，并且其 pH 值(pH=4.16)與不接菌的培養基(pH=6.90)相比明顯下降。ALEB 3A、ALEB 7A、ALEB 7B、ALEB 21、ALEB 29和ALEB 47發酵液中可溶性磷元素的含量均大于100 mg/L，并且其發酵液的pH值均低于5.00。但ALEB 14和ALEB 20發酵液的pH值分別為4.62和4.53，其發酵液中可溶性磷元素的含量卻較低，僅為(46.67±6.55)mg/L 和(60.95±21.33)mg/L。而 ALEB 2A、ALEB 31 和ALEB 34的溶磷量均超過了150 mg/L，但其發酵液的pH值卻均高于6.00。

2.6 茅蒼術內生細菌溶解有機磷的定量檢測及細菌發酵液pH值的測定

茅蒼術內生細菌中具溶解有機磷能力的菌株數要低于具溶解無機磷能力的菌株數，并且磷元素的釋放量也較低，2/3解有機磷菌株的磷元素釋放量低于5 mg/L。ALEB 4A溶解有機磷的能力最強，磷元素釋放量為(23.63±1.46)mg/L。同時測定菌液的 pH 值(圖6)。

3 討論

3.1 茅蒼術內生細菌多樣性

圖3 茅蒼術內生固氮細菌nifH基因的擴增Fig.3 Amplification of nifH genes from nitrogen-fixing endophytic bacteria

圖4 茅蒼術內生固氮細菌16S rDNA系統發育樹Fig.4 Phylogenetic dendrogram of the nitrogen-fixing endophytic bacteria from Atractylodes lancea based on the 16S rDNA fragments

本課題組的前期研究已經證明茅蒼術體內存在豐富的內生真菌資源，并且其對茅蒼術的生長和道地性的形成產生了很大影響。本研究通過ARDRA和BOXPCR相結合的方法揭示了茅蒼術內生細菌的多樣性。ARDRA是一種簡單而可靠的細菌分類方法［19］，能夠在16S rDNA片段的基礎上估計分離物中存在的最低限度的細菌種類數目［20］。許多研究者將ARDRA應用于不同來源細菌的初步分類與鑒定［8，21］。本研究中的14個ARDRA聚類簇代表菌株的16S rDNA序列測定結果表明分離得到的茅蒼術內生細菌與泛菌屬、微桿菌屬、短桿菌屬、農桿菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬細菌親緣關系相近，其中茅蒼術葉片優勢內生細菌與假單胞菌屬細菌親緣關系相近。這些屬的細菌均已被報道作為內生細菌存在于不同植物體內，其中一些還具有植物促生能力［22-25］。與ARDRA相比，使用BOX-PCR獲得的指紋圖譜能夠區分親緣關系更近的細菌菌株［26］，因此利用BOX-PCR對茅蒼術內生細菌主要ARDRA聚類簇6和9中的菌株進行分析。BOX-PCR指紋圖譜聚類分析結果表明，主要ARDRA聚類簇中的內生細菌菌株也具有豐富的多樣性。

圖5 茅蒼術內生細菌無機磷溶解量與發酵液pH值Fig.5 The amountofdissociative phosphorusreleased by inorganic phosphate solubilizing bacteria and the pH oftheir fermentation solutions

圖6 茅蒼術內生細菌有機磷溶解量與發酵液pH值Fig.6 The amount of dissociative phosphorus released by organic phosphate solubilizing bacteria and the pH of their fermentation solutions

3.2 茅蒼術內生細菌的促生潛力

氮、磷、鉀是植物生長發育過程中不可缺少的重要營養元素。在作物生長過程中常需要人工施加氮、磷、鉀等肥料以滿足作物對養分的需求。本研究獲得了多株具有固氮、溶解無機磷或有機磷、解鉀和產生長素能力的內生細菌。如果這些具有多種促生潛力的內生細菌菌株能夠與茅蒼術建立良好的共生關系，那么它們能夠為宿主植物提供更多可被利用的氮、磷、鉀元素和植物激素，這必然會對茅蒼術藥材的產量和品質產生有益影響。但本實驗中并沒有發現同時具有固氮、溶解無機磷和有機磷、解鉀和產生長素能力的內生細菌菌株，因此在生產實踐中可以將不同茅蒼術內生細菌組合使用，使它們協同發揮促生功能，從一定程度上解決茅蒼術栽培過程中土壤營養元素失衡的問題，增加蒼術藥材的產量和品質［27］。

依據16S rDNA序列測定結果構建的系統發育樹，茅蒼術內生固氮細菌分別與土壤桿菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和短小桿菌屬的典型菌株聚為一類，應屬于這些屬的不同種或同一種的不同菌株，而這些屬的細菌均已被報道具有固氮能力［24，28-29］。但不同無氮培養基間存在一定的差異，使用某一種無氮培養基進行固氮細菌的篩選不能夠得到所有具固氮潛力的細菌，茅蒼術體內應該還存在有其他種屬的固氮細菌有待于進一步的發現與研究。

ARDRA聚類簇6中的9個菌株均具有溶解無機磷的能力，并且其溶磷量與產酸能力呈正相關。因此，推測部分茅蒼術內生細菌通過分泌一些酸性物質來溶解磷酸鈣，釋放難溶性的磷元素。但有些內生細菌溶解無機磷的量很高，同時其菌液的pH值也較高。說明分泌酸性物質并不是內生細菌溶解磷酸鹽的唯一途徑，這些菌株可能通過分泌胞外磷酸酶來釋放磷元素，并且不同的作用途徑間可能存在協同。除ALEB 14和ALEB 47外，其他具溶解無機磷能力的菌株都與假單胞菌屬菌株近緣，這與之前研究報道的假單胞菌屬細菌溶解無機磷的能力相符［30］。具有機磷溶解能力的內生細菌菌株ALEB 10和ALEB 35經16S rDNA序列測定、比對，與巨大芽孢桿菌的相似度分別為99%和98%。巨大芽孢桿菌為已知的解磷菌種，并已經作為微生物菌劑廣泛使用［31］。細菌發酵液pH值的測定結果表明，內生細菌溶解有機磷的能力與其產酸能力無相關性。因此推測茅蒼術內生細菌通過分泌胞外磷酸酶來溶解卵磷脂，釋放磷元素。植物促生細菌在植物體外，通過釋放土壤中不溶性的磷元素，促進植物生長和次級代謝物積累的能力已有報道［32-33］。而植物內生細菌很可能來源于土壤，通過植物根部的自然孔洞或傷口侵入植物體內，成為植物體微生態體系的一部分，因此，可以利用內生細菌在植物根際土壤中的定殖來改善植物的磷素營養［34］。而具有解鉀潛力的內生細菌幾乎分布于各ARDRA聚類簇，不具有種屬差異。

大多數茅蒼術內生細菌能夠將培養基中的L-色氨酸轉化為IAA，并將其分泌至體外。雖然培養時間以及色氨酸含量可能對細菌的生長素產生量存在一定影響，但從本實驗獲得的結果可以看出很大一部分茅蒼術內生細菌具有較強的IAA產生能力，并且部分菌株產生長素的能力要大于一些實驗者分離得到的其他來源的細菌菌株［17］。雖然本實驗未對茅蒼術植株體內色氨酸的含量進行測定，但其作為植物合成IAA的前體物質，應當在菊科高等植物茅蒼術中也廣泛存在。因此，作者推測內生細菌在與茅蒼術建立共生后，可以利用植物體內游離的色氨酸合成IAA，供宿主植物使用。

綜上所述，本研究首次探究了江蘇省道地藥材茅蒼術葉片內可培養內生細菌的多樣性，并研究了其固氮、解磷、解鉀和產生長素的促生潛力。初步揭示了內生細菌與茅蒼術之間的相互關系，為進一步將內生細菌回接茅蒼術植株，研究其對茅蒼術藥材產量和道地性形成的影響提供了重要依據。

［1］ Guo L P，Huang L Q，Yan H，Lv D M，Jiang Y X.Habitat characteristics for the growth of Atractylodes lancea based on GIS.China Journal of Chinese Materia Medica，2005，30(8):565-569.

［2］ Gu Y H，Feng X，Xia B.Dynamic change of essential oil content and increment in different organs of Atractylodes lancea.Journal of Plant Resources and Environment，2007，16(4):24-28.

［3］ Wang Y，Dai C C，Cao J J，Xu D S.Comparison of the effects of fungal endophyte Gilmaniella sp.and its elicitor on Atractylodes lancea plantlets.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，28:575-584.

［4］ Chen J X，Dai C C，Li X，Tian L S，Xie H.Endophytic fungi screening from Atractylodes lancea and inoculating into the host plantlet.Guihaia，2008，28(2):256-260.

［5］ Loaces L，Ferrando L，Scavino A F.Dynamics，diversity and function of endophytic siderophore-producing bacteria in rice.Microbial Ecology，2011，61:606-618.

［6］ Fernández A，Huang S Y，Seston S，Xing J，Hickey R，Criddle C，Tiedje J.How stable is stable?Function versus community composition.Applied and Environmental Microbiology，1999，65(8):3697-3704.

［7］ Lu J K，Chen J，Kang L H，Yang Z D.Analysis of the 16S rDNA PCR-RFLP and the phosphate-dissolving capacity of phosphate-dissolving bacteria isolated from rhizosphere of mangrove in southern china.Scientia Silvae Sinicae，2009，45(5):137-142.

［8］ Yang J H，Liu H X，Zhu GM，Pan Y L，Xu L P，Guo J H.Diversity analysis of antagonists from rice-associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases.Journal of Applied Microbiology，2008，104:91-104.

［9］ Carlos C，Alexandrino F，Stoppe N C，Sato M I Z，Ottoboni L M M.Use of Escherichia coli BOX-PCR fingerprints to identify sources of fecal contamination of water bodies in the State of Sao Paulo，Brazil.Journal of Environmental Management，2012，93:38-43.

［10］ Park M，Kim C，Yang J，Lee H，Shin W，Kim S，Sa T.Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea.Microbiological Research，2005，160:127-133.

［11］ Rosch C，Mergel A，Bothe H.Biodiversity of denitrifying and dinitrogen-fixing bacteria in an acid forest soil.Applied and Environmental Microbiology，2002，68(8):3818-3829.

［12］ Li Z D，Chen X R，Li P，Man B Y，Wang C Y，Zou Y K，Xu C L.Identification of endogenous nitrogen-fixing bacteria of Polygonum viviparum and analysis on nitrogen fixation gene(nifH).Acta Agrestia Sinica，2009，17(5):552-557.

［13］ Dastager S G，Deepa1 C K，Pandey A.Plant growth promoting potential of Pontibacter niistensis in cowpea(Vigna unguiculata(L.)Walp.).Applied Soil Ecology，2011，49:250-255.

［14］ Tian H，Li F X，Zhang D G，Yao T.Primary research on isolation and ability of phosphorus-solubilizing of turf phosphorus-solubilizing bacteria.Pratacultural Science，2005，22(10):92-96.

［15］ Lin X G.Principles and methods of soil microbiology research.Beijing:Higher Education Press，2010:236-238.

［16］ Yang L，Tang W Q，Jiang Y，Duan Y P.Isolation，identification of a potassium-solubilizing bacteria and analysis of the metabolites.Journal of Anhui Agricultural Science，2011，39(28):17265-17267.

［17］ Martínez O A，Jorquera M A，Crowley D E，Mora M L.Influence of nitrogen fertilisation on pasture culturable rhizobacteria occurrence and the role of environmental factors on their potential PGPR activities.Biology and Fertility of Soil，2011，47:875-885.

［18］ Mishra A，Chauhan P S，Chaudhry V，Tripathi M，Nautiyal C S.Rhizosphere competent Pantoea agglomerans enhances maize(Zea mays)and chickpea(Cicer arietinum L.)growth，without altering the rhizosphere functional diversity.Antonie van Leeuwenhoek，2011，100:405-413.

［19］ Ponnusamy K，Jose S，Savarimuthu I，Michael G P，Redenbach.Genetic diversity study of Chromobacterium violaceum isolated from Kolli hills by amplied ribosomal DNA restriction analysis(ARDRA)and random amplified polymorphic DNA(RAPD).Letters in Applied Microbiology，2011，53:341-349.

［20］ Dunbar J，White S，Forney L.Genetic diversity through the looking glass:effect of enrichment bias.Applied and Environmental Microbiology，1997，63:1326-1331.

［21］ Sun L，Qiu F B，Zhang X X，Dai X，Dong X Z，Song W.Endophytic bacterial diversity in rice(Oryza sativa L.)roots estimated by 16S rDNA sequence analysis.Microbial Ecology，2008，55:415-424.

［22］ Ferrara F S，Oliveira Z M，Gonzales H H S，Floh E S，Barbosa H R.Endophytic and rhizospheric enterobacteria isolated from sugar cane have different potentials for producing plant growth-promoting substances.Plant and Soil，2012，353:409-417.

［23］ Ulrich K，Ulrich A，Ewald D.Diversity of endophytic bacterial communities in poplar grown under field conditions.FEMS Microbiology Ecology，2008，63(2):169-180.

［24］ Taule C，Mareque C，Barlocco C.The contribution of nitrogen fixation tosugarcane(Saccharum officinarum L.)，and the identification and characterization of part of the associated diazophic bacterial community.Plant and Soil，2012，356:35-49.

［25］ Bacon C W，Hinton D M.Endophytic and biological control potential of Bacillus mojavensis and related species.Biological Control，2002，23(3):274-284.

［26］ Binde D R，Menna P，Bangel E V，Barcellos F G，Hungria M.rep-PCR fingerprinting and taxonomy based on the sequencing of the 16S rRNA gene of 54 elite commercial rhizobial strains.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，83:897-908.

［27］ Guo L P，Huang L Q，Jiang Y X，Lv D M.Soil deterioration during cultivation of medicinal plants and ways to prevent it.China Journal of Chinese Materia Medica，2006，31(9):714-717.

［28］ Karagoz K，Ates F，Karagoz H.Characterization of plant growth-promoting traits of bacteria isolated from the rhizosphere of grapevine grown in alkaline acidic soils.European Journal of Soil Biology，2012，50:144-150.

［29］ Lin L，Guo W，Xing Y X.The actinobacterium Microbacterium sp.16SH accepts pBBR1-based pPROBE vectors，forms biofilms，invades roots，and fixes N2associated with micropropagated sugarcane plants.Applied Microbiology and Biotechnology，2012，93(3):1185-1195.

［30］ Srinivasan R，Alagawadi A R，Yandigeri M.Characterization of phosphate-solubilizing microorganisms from salt-affected soils of India and their effect on growth of sorghum plants［Sorghum bicolor(L.)Moench］.Annals of Microbiology，62(1):93-105.

［31］ Gyaneshwar P，Naresh K G，Parekh L J，Poole P S.Role of soil microorganisms in improving P nutrition of plants.Plant and Soil，2002，245(1):83-93.

［32］ Rana A，Saharan B，Joshi M，Prasanna R，Kumar K，Nain L.Identification of multi-trait PGPR isolates and evaluating their potential as inoculants for wheat.Annals of Microbiology，2011，61:893-900.

［33］ Arun P，Sanjay K，Ankit P，Sukhmal C.Microbial and chemical sources of phosphorus supply modulate the yield and chemical composition of essential oil of rose-scented geranium(Pelargonium species)in sodic soil.Biology and Fertility of Soils，2012，48:117-122.

［34］ Huang J，Sheng X F，He L Y.Biodiversity of phosphate-dissolving and plant growth-promoting endophytic bacteria of two crops.Acta Microbiologica Sinica，2010，50(6):710-716.

參考文獻:

［1］ 郭蘭萍，黃璐琦，閻洪，呂冬梅，蔣有緒.基于地理信息系統的蒼術道地藥材氣候生態特征研究.中國中藥雜志，2005，30(8):565-569.

［2］ 顧永華，馮煦，夏冰.茅蒼術不同器官揮發油含量及其生長量的動態變化.植物資源與環境學報，2007，16(4):24-28.

［4］ 陳佳昕，戴傳超，李霞，田林雙，謝慧.茅蒼術內生真菌的分離鑒定及在組培苗中的回接.廣西植物，2008，28(2):256-260.

［7］ 陸俊錕，陳俊，康麗華，楊振德.華南紅樹林溶磷菌16S rDNA PCR-RFLP分析及其溶磷能力.林業科學，2009，45(5):137-142.

［12］ 李振東，陳秀容，李鵬，滿百膺，王辰月，鄒雨坤，徐長林.珠芽蓼內生固氮菌鑒定及其固氮基因分析.草地學報，2009，17(5):552-557.

［14］ 田宏，李鳳霞，張德罡，姚拓.草坪草溶磷菌及溶磷能力的初步研究.草業科學，2005，22(10):92-96.

［15］ 林先貴.土壤微生物研究原理與方法.北京:高等教育出版社，2010:236-238.

［16］ 楊柳，唐旺全，蔣艷，段月鵬.解鉀芽孢桿菌的分離·鑒定及其代謝產物分析.江蘇農業科學，2011，39(28):17265-17267.

［27］ 郭蘭萍，黃璐琦，蔣有緒，呂冬梅.藥用植物栽培種植中的土壤環境惡化及防治措施.中國中藥雜志，2006，31(9):714-717.

［34］ 黃靜，盛下放，何琳燕.具溶磷能力的植物內生促生細菌的分離篩選及其生物多樣性.微生物學報，2010，50(6):710-716.