微囊藻毒素對陸生植物的污染途徑及累積研究進展

靳紅梅，常志州

(江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，江蘇省農業廢棄物資源化工程技術中心，南京 210014)

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是水體中某些藍藻(Cyanobacteria)，特別是微囊藻(Microcystis)分泌產生的一類具有生物活性的環狀七肽物質，是一種具有強烈致癌作用的肝毒素［1］。近年來，富營養化導致各水體中藍藻水華的發生頻率及嚴重程度都呈現增長的趨勢［2］，堆積的藻類細胞衰亡后會釋放出大量的藍藻毒素及其他有毒有害物質［3-5］。MCs是目前已經發現的污染范圍最廣、研究最多的一類藍藻毒素［6］，在其分子生物學［7］、環境歸趨［4，8-10］、在水生生物中的富集［11-14］等方面已取得了進展，其多種特性已被揭示，也使得人們對其特點和危害有了更加深入的了解［15］。

藻細胞釋放的MCs不僅對直接接觸的水生生物造成嚴重的危害，而且會隨著水圈與土壤圈和生物圈之間的物質交換進入陸生植物體內［16-17］，進而通過食物鏈嚴重威脅到人類健康［15，18-20］。近些年，MCs對陸生植物的毒害和累積研究受到越來越多的關注，取得了一批重要的研究成果。我國是世界上藍藻水華暴發最嚴重、分布最廣、毒素種類最多的國家之一［21］。在已發現的80多種MCs異構體中［22］，MC-LR(L為亮氨酸)和MC-RR(R為精氨酸)是淡水水體中普遍存在且危害較大的兩種MCs［4］(圖1)。因此，本文重點介紹這兩種類型的MCs進入陸生植物體的途徑、毒性作用及其在作物體內的富集。在使用污染水源灌溉或土壤種植作物條件下，對正確評估MCs的生物安全風險有重要意義。

1 MCs進入陸生植物體內的主要途徑

土壤是聯系水體和生物之間的重要紐帶，水體中的MCs不可避免地通過多種途徑進入土壤，因此，MCs在土壤中的環境行為直接影響了其在陸生植物中的遷移和累積。MCs進入土壤界面的主要途徑有:(1)使用藍藻水華污染的水源進行灌溉［23-24］;(2)機械收集藍藻后不合理的堆放及還田等資源化處理［25］;(3)人工濕地進行富營養化修復和河岸沙濾水處理工藝及粘土濾床水處理工藝等［26-27］;(4)洪澇災害將含有藍藻水華和毒素的水帶入土壤界面［1］。其中，前兩種途徑最為常見，也是本文關注的重點。

天然水體中的MCs有3種主要的存在形態，即溶解態(游離態)、細胞結合態和吸附態［1，18］。藍藻分泌的大部分MCs易溶于水［28］，但在藻類生長周期里的大部分時間，細胞結合態的MCs在水體中占絕大部分［29］。通過機械方法收集水面漂浮的水華以減輕污染日趨成為富營養化湖泊整治的主要手段。將大量采集的藍藻生物量進行資源化利用，特別是當作有機肥料直接還田時，勢必造成細胞結合態的MCs在土壤中的釋放、遷移，甚至造成地下水污染，進而進入作物體內［18］。自然水體中細胞結合態的MCs大量釋放一般出現在藍藻水華大量衰亡的季節，或水體中使用了殺藻劑后。已報道的自然水體中 MCs的含量一般為0—10 μg/L［4，30-31］，多數水體中溶解態 MCs的含量不會超過 1 μg/L［1］。盡管如此，用富營養化水體進行灌溉仍然會導致其中痕量的溶解態MCs遷移到作物體內［16，23］。在地表水豐富的地區(如我國南方地區)，引湖水或河水入田是常用的灌溉措施;而在干旱地區，抽取地下水或利用水庫水是灌溉水的主要來源。一旦這些水源受到藍藻水華污染，用其灌溉均可能導致溶解態的MCs在陸生植物體內的累積。

圖1 微囊藻毒素通用的化學結構式［1］Fig.1 Chemical structure of microcystins［1］

1.1 地表水灌溉

在我國，作為地表水重要來源的湖泊已有85%出現了不同程度的富營養化現象［32］，是藍藻水華發生最嚴重的水體。江蘇太湖、云南滇池和安徽巢湖都暴發過嚴重的藍藻水華，其他省市各水體也都有不同程度的暴發［33］。2005年在太湖五里湖和梅梁灣檢測的表層水最大胞外MCs濃度分別為2.71 μg/L和6.66 μg/L［4］;2009年—2010年太湖梅梁灣水體(表層、中層和下層的混合樣品)中MCs濃度最高為0.78 μg/L，最低為0.14 μg/L［34］;滇池海東灣 MCs的濃度在0.05—0.89 μg/L 之間，馬村灣在0.03—0.48 μg/L 之間［35］;安徽巢湖水體中 MCs濃度可達 17.29 μg/L［36］;淀山湖夏季湖水中 MCs的濃度在 0.4—1.5 μg/L 之間［37］;鄱陽湖水體 MCs 濃度最高為 1.037 μg/L［38］。

近年來，我國各地的河流和溝塘中藍藻污染也明顯增加。例如，淮河流域MC-RR濃度最高可達17.73 μg/L［39］;贛江水樣MCs濃度為0.04—1.36 μg/L［40］。在原發性肝癌高發地區江蘇海門等地的許多河水和溝塘中也檢測出了大量的 MCs，最高為 1.558 μg/L 和 0.3 μg/L［41］。

國內很多水庫中均有MCs被檢出的報道［42-47］。福建山仔水庫10月份藍藻水華產生的MC-LR濃度最高為 11.43 μg/L［43］;官廳水庫水體中 MC-LR 的平均濃度為 0.794 μg/L［44］，7 月份 MCs 的最高值為 20 μg/L［47］;密云水庫9月份MC-LR和MC-RR的濃度分別為41 ng/L和18 ng/L［45］。甚至在喀斯特高原的深水水庫中，MC-RR含量也可達2.84 μg/L［46］。因此，用富營養化的地表水進行灌溉意味著MCs進入農作物的可能性增大。

1.2 地下水灌溉

MC-RR和MC-LR均屬于移動性較強的有機化合物［25］，湖泊和河流中的MCs可能通過淋溶進入地下水系統［48］。粘性顆粒越少的土壤中，MCs越易遷移［25］。盡管土壤對 MCs有一定的吸附［17］和降解［49］作用，但是Eynard等也報道了在藻類暴發季節，土壤未能有效降解湖水中的MCs，最終導致地下水污染［27］。地下水系統長期處于厭氧條件，缺乏電子受體、碳源［50］，特別是缺乏分解MCs的微生物，因此該系統的MCs存在的時間(約100 d)［50］遠高于其在地表水中的存在時間(約28 d)［51］。Mohamed等通過對阿西爾地區的10口地下水井的水進行取樣測定后發現，MCs濃度為0.3—1.8 μg/L［16］，大多數超過WHO制定的飲用水中MCs的指導值［52］;用此濃度的水灌溉附近農田的6種蔬菜，在它們體內均檢測出MCs，含量為0.07—1.2 μg/g(鮮重)。因此，通過淋溶作用進入地下水的MCs也可能通過灌溉而進入陸生植物體內，從而對人體健康造成威脅。

1.3 施用藍藻肥料

由于藍藻水華污染在全球范圍內日趨嚴重，各國都加大了對富營養化湖泊的整治力度，其中嘗試之一是通過機械方法收集水面漂浮的水華以減輕污染［1］。自2007年我國太湖藍藻嚴重暴發后，各科研單位通過一系列的藍藻治理研究及實踐工作證明，打撈藍藻作為終端控制途徑有效降低了水污染災害，是改善水質的一種有效手段。打撈后的藍藻作為肥料還田是其主要的資源化利用途徑，但這勢必造成細胞結合態的MCs在土壤中的釋放、遷移，進而進入植物體［1，18］。

藻類生長周期里的大部分時間，溶解態MCs的含量維持在較低的水平，即使在我國滇池富營養化污染十分嚴重的季節，水體中溶解態的MCs含量也基本在1 μg/L以下［35，53］，但是細胞內的毒素則會高出幾個數量級［31］。打撈會使藻類快速死亡，造成細胞破裂后MCs大量釋放并表現出毒性［54］。盡管土壤對MCs有一定的吸附和降解能力，但并不穩定，會隨著土壤條件(如機械組成、有機質含量、pH值、環境溫度等)發生變化［25］。MC-LR和MC-RR屬于移動性較強的有機化合物［25］，直接施用藍藻作為土壤肥料是不安全的，很可能引起地下水污染。此外，MCs在完全降解前仍要在土壤中滯留一段時間，這也將對暴露在該環境下的土壤微生物和植物生長產生威脅。

為高效、安全地實現打撈藍藻的資源化利用，避免二次污染，江蘇省農業科學院根據其特點，已設計出較為完善的藍藻好氧堆肥化處理工藝。藍藻腐熟后MCs的降解率可達90%以上，即MC-LR和MC-RR的殘留量分別在30 μg/kg(干重)和15 μg/kg(干重)以下(本研究室研究結果，待發表)。雖然好氧堆肥對MCs的生物降解十分有效［55］，但是農田施用量較大，藍藻肥料中殘留的MCs很可能會對作物生長和人類健康產生安全風險［56］，而國內外對藍藻肥料施用的生物安全及MCs作用閾值等問題的研究尚處于起步階段。

2 微囊藻毒素對陸生植物生長的影響

自Kós等首次報道了藍藻粗提物對陸生植物白芥(Sinapis alba)幼苗生長有抑制作用以來［57］，越來越多的研究表明(表1)，即使是微量的MCs也會對陸生植物的種子萌發［58-59］、個體生長［60-62］、形態、生理生化性質等［58，62-63］產生影響，主要表現在幼苗發生變形、重量減輕、側根減少、葉片的光合作用率降低等方面［58，62-63］，甚至會抑制植物根系與微生物共生體的形成［58］。

進一步研究發現，MCs能強烈抑制植物中蛋白磷酸酶1和2A(PP1，PP2A)的活性［61，64］，影響營養物質的吸收、遷移及根韌皮部的功能，由此影響莖葉的生長［60-62］，干擾茉莉酸信號轉換［65］，影響一些特殊酶的活性，如脫氧核糖核酸酶(DNase)［66］、尿黑酸葉綠醇轉移酶(HPT)［67］等。受MCs脅迫的植物會產生氧化應激反應［68］，如增加超氧化物歧化酶(SOD)［69-72］、過氧化物氧化酶(POD)、［71-72］、抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)［69-70］、谷胱甘肽 S 轉移酶(GST)［72-73］、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)［72-73］等酶活性，及增加生育酚的含量［67］。

3 微囊藻毒素在陸生植物中的累積

早期MCs對陸生植物的影響研究主要側重于用植物來進行毒性評價［18］，大多數試驗中MCs的暴露濃度遠遠高于環境水平;而定量地報道植物組織中MCs累積量的研究開展得較晚，數量也不多［17］。現有研究主要針對的陸生植物為蔬菜，對糧食作物和牧草也進行了少量研究。前期的研究認為，MCs對成熟植株的影響較幼苗要小［17］，因而目前國內外對MCs在陸生植物體內累積效應的研究多見于幼苗。

3.1 微囊藻毒素在陸生植物幼苗中的累積量

國外對MCs在幼苗體內累積的定量研究開展得較早，且大部分是在室內進行的短期試驗(表2)。多數的研究表明，植物幼苗體內MCs的含量與其在MCs環境中的暴露時間和暴露濃度呈顯著正相關關系［68，77］，但不同植物對各類毒素(MC-LR和MC-RR)的響應濃度不同。例如，十字花科植物所分泌的異硫氰酸(脂)，可減輕MCs對植物產生的毒害［58］。

表1 微囊藻毒素類型和濃度對陸生植物的作用Table 1 Effect of type and concentration of microcystins on terrestrial plants

Kurki-Helasmo和Meriluoto［60］通過固體培養基對白芥(Sinapis alba)幼苗進行了7 d暴露試驗，結果發現:MC-RR濃度為0.5—1 μg/mL的條件下，幼苗株高低于對照，但是株型沒有多少變化;在大于5 μg/mL時，幼苗出現畸形莖。MC-RR和MC-LR對白芥生長的半數抑制量(IC50)分別為0.8 μg/mL和2 μg/mL。J?rvenp??等［17］用含有MCs的水灌溉西蘭花(Brassica oleracea var.italica)和白芥(Sinapis alba)后發現，灌溉水中MCs的濃度為1 μg/L 和10 μg/L 時，灌溉19—20 d 后(最終 MCs總量為2.6 μg、26 μg 和2.3 μg、23 μg)僅在幼苗根部檢測到了 MCs，分別為0.9—2.4 μg/kg(鮮重)和2.5—2.6 μg/kg(鮮重)。Peuthert等［78］通過對11 種大田作物幼苗的暴露試驗發現，在MC-LR濃度為5 μg/L的條件下放置24 h，對MCs吸收量最大的作物為苜蓿(Medicago sativa)，其根中MCs含量約為88 μg/kg(鮮重)，莖中約為44 μg/kg(鮮重);吸收量最小的作物為紅豆(Vigna radiate(L.)R.Wilcz.)，根中約為 8 μg/kg(鮮重)，莖中約為 4 μg/kg(鮮重)。Saqrane 等［56］通過溫室砂培試驗發現，禾本科作物小麥(Triticum durum)在MC-LR濃度為0.5—1.05 mg/L的條件下暴露30 d后，除根中檢測到MC-LR外，莖和葉中均未檢測到MC-LR含量，而玉米(Zea mays)幼苗的根、莖、葉中均可檢測到MC-LR;豆類對MC-LR的吸收量較這兩種禾本科作物大，豌豆(Pisum sativum)和兵豆(Lens esculenta)在MC-LR濃度為4.2 mg/L時，對MC-LR的吸收量是前兩種禾本科作物的2—16.9倍。

近幾年，國內關于MCs在植物幼苗體內的累積研究也逐漸增多。雖然不同植物對MCs的耐受濃度不同，但其幼苗體內MCs的累積規律基本與國外研究一致。Chen等［68］發現，水稻(Oryza sativa)幼苗對MC-LR的耐受濃度為0.12 mg/L，而油菜(Brassica napus)幼苗在此濃度下已經開始萎蔫。將二者暴露在滇池藍藻粗提物(MC-LR濃度為3 mg/L)10 d后發現，其幼苗中MC-LR的最大含量分別為651 μg/kg和5.4 μg/kg。通過對蘋果苗的組織培養發現，在MC-LR濃度超過0.3 mg/L時，蘋果苗的生物量顯著降低［77］。江蘇省農業科學院對作物幼苗中MCs的積累量方面進行了一系列的研究。通過對牧草的研究發現，白三葉(Trioflium repens)幼苗［79］對MC-RR的耐受濃度為0.05 mg/L，而黑麥草(Lolium perenn)［80］幼苗對MC-LR的耐受濃度為4 mg/L。通過對蔬菜的研究發現，油菜(Brassica napus)幼苗對MC-RR的耐受濃度為5 mg/L［70］，青菜(Brassica chinensis)幼苗對MC-LR的耐受濃度為0.8 mg/L［69］;而小白菜(Brassica rapa)和番茄(Solanum lycopersicum)對MC-LR的耐受濃度為0.5 mg/L，超過此濃度二者的種子發芽率顯著降低，幼苗的苗高和根長均受到顯著抑制［81］。

3.2 微囊藻毒素在陸生作物成株中的累積量

除了實驗室條件下對植物幼苗進行暴露試驗，自然條件下MCs在作物中的累積作用及其安全正受到越來越多的關注［76］。但該領域的研究開展得較晚，國外主要集中在使用含有藻類或痕量溶解態MCs的富營養化水源灌溉作物這方面，而國內目前僅見于耿志明等關于MCs在番茄(Solanum lycopersicum)中的積累研究［81］(表2)。

1999年，Codd等首次報道了用含有Microcystis aeruginosa(MC-LR含量為3.23 mg/kg(干重))的水灌溉生菜(Lactuca sativa)，收獲后測定葉片基部MC-LR含量為0.094 mg/kg(干重)，葉片末梢為0.883 mg/kg(干重)，葉片中部為2.487 mg/kg(干重)［24］。但此后，鮮有MCs在陸生植物成株中累積的相關報道。直到2008年，Crush等用富營養化湖水(MCs總濃度約為1.6 mg/L)灌溉油菜(Brassica napa cv Winfred)、黑麥草(Lolium perenne cv Grasslands Samson)和白三葉(Trifolium repens cv Grasslands KopuⅡ)等作物后發現，其地上部MCs的累積量達到0.20—0.79 mg/kg(干重)，根部達到0.12—1.45 mg/kg(干重)。隨后，Mohamed等［16］報道了用MCs濃度(為0.3—1.8 μg/L)更低的井水灌溉6種蔬菜，結果發現蔬菜體內MCs含量與灌溉水中MCs的含量呈極顯著正相關關系。盡管使用此類井水灌溉不會對作物生長產生明顯影響，但是收獲后作物體可食用部分的MCs含量達0.05—1.2 μg/g(鮮重)［16］。如果按每人每天食用量為0.5 kg(鮮重)計算，則每人一天可攝入的MCs為25—600 μg，遠高于 WHO［52］及我國［82］推薦飲水中 MCs的上限標準值，對人類健康安全帶來風險。

除了用污染的水源灌溉農田外，機械收集后的藍藻當作有機肥料還田是造成胞內結合態的MCs在作物中累積的一個重要途徑，但藍藻肥料是否會對人類健康產生真正的威脅尚無確切的答案。圍繞這一問題，本研究室開展了一系列的蔬菜砂培和土培試驗，以研究藍藻肥料的生物安全及MCs的作用閾值等問題。初步的研究表明，進入土壤的MCs含量可能因為生物降解、吸附和地表光解等因素而大幅降低。用初始藍藻添加量為0.375 kg/kg(416 μg MCs/kg)的土壤種植青菜(Brassica chinensis)，種子無法正常出苗;而放置30 d后，土壤中的MCs降低為39 μg/kg，青菜正常生長，且收獲后其食用部分均未檢出MCs含量(LC/MS儀器的檢測下限為10 ng/kg)。如果施用25000 kg/hm2充分腐熟的藍藻肥料(MC-LR和MC-RR的殘留量分別為30 μg/kg(干重)和15 μg/kg(干重))，進入土壤的MC-LR和MC-RR的最大量分別為0.75 g/hm2和0.38 g/hm2，遠低于湖水灌溉帶入農田的MCs的量，青菜體內MCs的含量小于10 ng/kg(本研究室研究結果，待發表)。但施用藍藻肥料是否會導致其它作物的可食用部分MCs含量超標，仍需要長期、深入和系統的研究。

3.3 微囊藻毒素的生物富集系數

生物富集系數(BCF)是指示化學物質在生物體內累積趨勢的重要指標。已有文獻報道中，MC-LR和MC-RR在植物地上部分的累積系數分別在0.021—1.63和0.40—9.87之間;MC-LR在植物地下部分的累積系數在0.82—8.8之間(表2)。總起來看，植物地下部分對MCs的吸收和累積量更大。MCs除了在黑麥草中的累積系數隨著暴露量的增加而增加［80］，其他研究均表明，陸生植物體內的BCF隨著暴露量的增加而減小。這說明MCs的富集系數與單位鮮重的含量不成正相關，并不隨著處理濃度的增加而增加。此外，MC-LR的生物富集系數顯著高于MC-RR，原因仍需要進一步分析。

MCs對農作物的毒性效應較為復雜，不同結構的MCs表現出毒性差異，不同的植物類型和生長階段對MCs的敏感度也不同。此外，不同的培養條件、測定方法［17］等外部因素，對植物體內MCs的檢測量也有影響，可能導致其生物富集系數有誤差。

4 展望

如何控制并有效治理藍藻水華污染已成為世界各國共同面臨的一個環境科學難題。日趨嚴重的富營養化污染已經導致我國成為藍藻水華頻發的地區，所產生的MCs嚴重威脅水生生態系統及人類健康。前期人們對MCs的研究更多地集中在毒素的產生、理化性質的分析檢測、對哺乳動物的致毒機理、積累與遷移，以及對人類健康風險的研究。隨著藍藻污染水體的范圍逐漸增大，MCs通過物質交換、灌溉等方式進入土壤，在陸生植物，特別是在作物中的累積日益引起人們的關注。因此，加強MCs對人類健康影響的風險評估，量化MCs的生物安全閾值，在MCs污染水域的農業生產中保證農產品質量等方面的研究亟待突破性進展。

通過前期的研究工作，已經認識到土壤在MCs由水體向人體的遷移轉化過程中起著十分重要的作用，具有凈化功能和傳遞功能。土壤可通過吸附作用和微生物降解進行MCs的凈化，同時MCs可通過灌溉水或施用藍藻肥料經土壤向作物傳遞，并在作物中累積。但尚有一些問題亟需解決，如對于MCs在土壤中的遷移轉化機制及對土壤的生態效應認識尚淺，對于其降解能力的驅動因子研究不夠深入;自然條件下，低濃度(不超過1 μg/L)MCs對農作物的影響未有深入研究;缺乏MCs污染水域周邊土壤和作物中MCs含量的調查數據，無法估計MCs對人類健康影響的風險值;缺乏對藍藻肥料中MCs含量的限制及其生物效應的研究;MCs污染程度與作物受害程度以及作物中累積量的劑量效應關系還不明確，等等。

針對目前研究的現狀，作者認為在今后還需要重點進行以下幾方面的研究:

(1)加強土壤在MCs遷移轉化過程中的功能及作用機制研究。研究不同土壤類型、土壤性質對MCs的吸附-解吸特征，MCs在土壤中的生物降解作用和土表光解作用及其速率、機理、影響因素，以及土壤中MCs的生物效應(如MCs對土壤酶活性、微生物、動物和根系生長的影響)，為MCs污染水體的土地處理提供理論、方法、工程設計和管理依據;

(2)闡明MCs的劑量-效應關系及其生態風險，建立基于生物安全風險的農業灌溉用水或藍藻肥料中MCs的限值。調查研究MCs污染水域周邊土壤-作物系統中MCs的含量、分布、傳遞及積累規律，為有效控制MCs在土壤-農作物系統中的遷移、生態風險和健康風險奠定基礎;

(3)制定相關的標準，對藍藻肥料制作的技術和方法進行規范，對其生物安全性進行評估。

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