傳代對殘耳軟骨細胞體內軟骨形成能力的影響

康寧 劉霞 曹誼林 肖苒

先天性小耳畸形表現為耳廓發育不全，即正常輪廓缺失，遺留小團軟骨塊或皮贅。該類患者的殘耳軟骨取材簡便，不損傷正常生理結構，在基于組織工程技術的耳廓再造中具有重要的應用價值。我們在前期研究中已明確體外構建成人大小耳廓軟骨所需要的殘耳軟骨細胞總量、代次及其與表型的關系。但是，細胞在體外的生物學特性會受到體內微環境的影響，體外擴增的殘耳軟骨細胞最終在體內的軟骨形成能力仍不清楚。本實驗通過比較第3～8代殘耳軟骨細胞與材料復合在體內形成的組織工程化軟骨，明確體外傳代對殘耳軟骨細胞體內軟骨形成能力的影響，為臨床應用提供理論基礎與技術參數。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

經本院倫理委員會批準，樣本取自3例Ⅲ期耳廓再造術患者廢棄的殘耳軟骨，患者年齡7～13歲，均已知情同意。

1.2 主要試劑和材料

無紡聚羥基乙酸（PGA，組織工程國家工程中心），聚乳酸（PLA，Sigma 公司，USA），堿性成纖維細胞生長因子（Peprotech公司，美國），兔抗人Ⅱ型膠原多克隆抗體、三步法免疫組化檢測試劑盒SP-9001、濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.3 殘耳軟骨細胞的分離培養

將殘耳軟骨剝離軟骨膜，切成2 mm×2 mm×2 mm小塊，以0.25%胰蛋白酶消化20min，PBS沖洗3次，0.2%Ⅳ型膠原酶37℃搖床消化8～12 h，200目濾網過濾，2000 r/min離心8min，錐蟲藍染色檢查細胞活力并計數，以 1.5×104cells/cm2的密度接種，加入培養基（10 ng/mL bFGF，DMEM-LG，10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，0.1 mg/mL鏈霉素），置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的培養箱內，4 d傳代1次。分別收集第3～8代殘耳軟骨細胞用于組織工程軟骨構建。

1.4 生物支架的制備

將PGA均勻嵌入預制的圓柱狀（直徑5 mm，厚度1.5 mm）硅膠模具內，滴加0.1%的聚乳酸（Polylactic acid，PLA）二氯甲烷溶液約 50μL，自然干燥后，75%乙醇消毒，PBS洗滌3次，培養基預培養過夜，準備接種細胞。

1.5 細胞-支架復合物的體外培養和體內植入

收集第3～8代細胞，分別以6.0×107cells/mL濃度接種至PGA/PLA支架材料。根據細胞代次設為6組（n=10），以普通培養基培養（DMEM-LG，10%胎牛血清，100 U/mL 青霉素，0.1 mg/mL 鏈霉素），1 周換液3次；體外培養4周后，部分取材行軟骨相關檢測，其余的植入裸鼠體內觀察8周。

1.6 相關檢測

1.6.1 大體觀察

觀察各代細胞-材料復合物在體外培養4周后及植入體內8周后的大小、形狀、質地和色澤。

1.6.2 組織學檢測

對各組標本進行HE、番紅O、維多利亞藍染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色。

1.6.3 Real-time PCR檢測

留取體外培養4周各代復合物標本進行總RNA提取、逆轉錄和Real-time PCR反應，檢測的基因、引物序列如下所示。GAPDH：5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTG-3'，5'-GAAGCTCACTGGCATGGC-3'；COL2A1：5'-AGGTCACAGAGGTTATCCAG-3'，5'-GTCCGTCCTCTTTCACCAG-3'；SOX9：5'-TCTACACACAGCTCAC-3'，5'-TGGGTTCGAGTTGCCTTTAG-3'；DLK1：5'-CGAGCACCGTATCCTGAAG-3'， 5'-AGGATGGTAAAGCAGATGGC-3'。

1.6.4 生物力學檢測

對體內8周的各組標本進行彈性模量檢測。

1.7 統計學分析

所得數據以均數±標準差表示，SPSS17.0軟件進行統計，應用One way-ANOVA進行分析，P<0.05為差異具有顯著性。

2 結果

2.1 體外培養4周

2.1.1 大體及組織學

第3～8代細胞-支架復合物均未形成基質飽滿的類軟骨組織。復合物接種后的早期生長階段，僅有少量新生基質分泌，且隨代次的增高，細胞-材料復合物的新生基質越疏松（圖 1，A～F）。

HE染色結果與大體表現吻合，只見細胞與稀少的新生基質，以及大量未降解的PGA纖維（圖1，A1～F1）。番紅O染色結果僅表現為淡染的紅色背景（圖1，A2～F2）。Ⅱ型膠原免疫組化染色結果與番紅O 染色結果一致（圖 1，A3～F3）。

2.1.2 軟骨相關基因的表達

第3～8代復合物體外培養4周后，COL 2A1的表達水平在第5代后明顯下調（P<0.05）（圖2，A）。SOX 9在第3、4代的表達水平顯著高于第5～8代（P<0.05）（圖 2，B）。 DLK 1 的檢測結果與 SOX 9 相似，第3、4代殘耳軟骨細胞構建的組織中DLK 1維持較高水平的表達，但只在第3代和其他代次之間檢測到統計學差異（P<0.05）（圖 2，C）。

2.2 體內植入8周

2.2.1 大體及組織學

第3～6代細胞-支架復合物經體內8周重塑后，形成了與原支架等大的類軟骨組織，色微黃且觸之有彈性（圖3，A～D），而第7、8代殘耳軟骨細胞構建的復合物萎縮成一小團纖維組織（圖3，E～F）。

HE染色結果顯示，第3～6代殘耳軟骨細胞構建的復合物中均能見到典型的軟骨結構，第3、4代復合物形成的軟骨結構較多（圖 3，A1、B1），隨代次增高軟骨結構減少，纖維組織增多（圖 3，C1、D1），且第7代復合物中只有極少數的島狀軟骨形成（圖3，E1），至第 8 代僅有纖維組織（圖 3，F1）。 番紅 O染色結果示，第3、4代復合物陽性著色較為均一（圖3，A2、B2），第5～7代細胞構建的復合物其軟骨結構紅染，纖維組織呈陰性（圖3，C2～E2），第8代的全部組織均呈陰性染色（圖3，F2）。Ⅱ型膠原免疫組化染色和維多利亞藍染色結果與番紅O結果一致（圖3，A3～F3，A4～F4）。

2.2.2 生物力學性能

體內植入8周后，各組復合物的彈性模量隨代次增加逐漸降低，第3～6代復合物的彈性模量明顯高于第 7、8 代（P<0.05）（圖 4）。

圖1 各組復合物體外培養4周大體及組織學觀察（標尺：100 μm）Fig.1 Gross and histological observation of each group after cultured for 4 weeks in vitro(Scale:100 μm)

圖2 各組復合物體外培養4周后軟骨相關基因的表達Fig.2 The expression of chondrocyte specific genes in each group after cultured for 4 weeks in vitro

圖3 各組復合物體內植入8周后大體及組織學觀察（標尺：100 μm）Fig.3 Gross and histological observation of each group after cultured for 8 weeks in vivo(Scale:100 μm)

圖4 各組復合物體內培養8周后的彈性模量（*：P<0.05）Fig.4 The elastic modulus in each group after cultured for 8 weeks in vivo(*:P<0.05)

3 討論

殘耳軟骨細胞是耳廓軟骨組織工程極具研究及應用價值的種子細胞[1-2]。我們在前期研究中發現，殘耳軟骨細胞和正常耳軟骨細胞一樣在體外傳代過程中極易發生去分化，細胞傳至第3代時軟骨表型已十分微弱，到第4代已基本消失。衡量軟骨細胞臨床意義的重要指標是體內的成軟骨能力。因此，本實驗將殘耳軟骨細胞從第3代連續擴增至第8代，將各代細胞分別接種于PGA/PLA三維支架上，在體外培養4周后植入體內，研究傳代對殘耳軟骨細胞體內成軟骨能力的影響。我們發現，雖然第3～8代細胞-材料復合物在體外培養4周后均不能形成軟骨組織，但植入體內8周后，第3～6代復合物均有不同程度的軟骨結構形成，說明適當的微環境的確能改善軟骨細胞的去分化現象[3-6]。

雖然體外4周時，各組在組織學水平上未能形成典型的軟骨結構，但軟骨轉錄因子SOX 9在第3、4代顯著高于其他代次。DLK 1是決定細胞分化的關鍵基因，并與軟骨分化關系密切[7-9]。Harkness[10]證實，DLK 1可作為有軟骨分化潛能的軟骨祖細胞的標記。我們檢測了DLK 1在不同代次細胞-材料復合物中的表達情況，發現其與SOX 9表達基本一致，在第3、4代中表達水平較高。另外，體內重塑8周后，組織學染色可見第3、4代復合物中均有大量軟骨結構形成，且隨代次增高而減少，纖維組織逐漸增多。我們推測，SOX 9和DLK 1可作為檢測傳代過程中軟骨細胞是否保留體內成軟骨潛能的標志分子。此外，第3～6代軟骨組織的彈性模量顯著高于第7、8代復合物，說明即使組織中混雜不同程度的纖維組織，但只要有一定量的軟骨結構，整個組織便可維持一定水平的生物力學特性。

綜上所述，我們認為殘耳軟骨細胞體外擴增至第4代時，仍能保持良好的體內成軟骨能力；第7、8代殘耳軟骨細胞復合物在體內8周后只形成了纖維組織，表明軟骨細胞已喪失了成軟骨能力，提示擴增傳代對殘耳軟骨細胞軟骨表型去分化的影響在第7代后已無法逆轉。

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