超高效液相色譜法快速測定水產品中藥物殘留

貝亦江，王 揚，何 豐，吳 瑩

(1.浙江省水產技術推廣總站，浙江杭州 310012;2.浙江經貿職業技術學院，浙江杭州 310018)

四環素類藥物由放線菌產生，主要包括土霉素、四環素、金霉素及半合成的抗生素，屬廣譜抗生素。由于其具有良好的殺菌抑菌作用，作為藥物添加劑被廣泛應用于防止動物及水產品的疾病感染。若不合理地使用四環素類藥物，易誘導耐藥菌株，并在食物中殘留，長期食用含有這類藥物的動物產品及其制品會嚴重危害人體健康。

各國針對進出口動物組織及相關產品中的四環素類藥物殘留量做出了最高殘留量規定，并且建立了多種檢測方法:微生物法、放射免疫檢測法、金標快速檢測試紙法、酶聯免疫吸附測定法、薄層色譜法、HPLC法、UPLC法及LC-MS法等。其中，微生物法的原理及操作簡單，但檢測時間長、靈敏度低、特異性差、易干擾;放射免疫檢測法存在放射性污染和標記物不穩定等問題，應用較少;金標快速檢測試紙法操作簡單、快捷，雖重復性和穩定性好，但靈敏度較差;酶聯免疫吸附測定法操作方便，儀器簡單，靈敏度高，專屬性強，適用于大批量樣品的檢測分析，廣泛應用于動物性食品中四環素類藥物的檢測，但檢測結果存在一定的假陽性，且只能測定四環素類藥物的總殘留量;薄層色譜法檢測方法簡便、快速，且不需復雜儀器，廣泛應用于快速定性檢測，但分辨率和靈敏度較低;HPLC法可進行準確定量測定，具有高效、快速、靈敏度和檢出限高的優點，在對同類藥物多殘測方法中精密度好，回收率高，可廣泛應用于動物性產品中抗生素殘留量的監測和監控，但不能準確定性，尤其是對違禁藥物的定性檢測;LC-MS法是所有檢測方法中提供信息量最多的一種檢測方法，既可準確定量，又可準確定性，靈敏度高，但通常樣品前處理較復雜，且儀器昂貴，因此不易推廣應用。

本研究采用了四環素類快速檢測前處理試劑盒中提取劑提取樣品中的有效成分，再用固相萃取法進行凈化，最后用超高效液相檢測分析，從而同時檢測出四環素、土霉素、金霉素3種四環素類抗生素的殘留。結果表明，運用SPE凈化樣品，減少了樣品中的雜質對儀器產生的污染，提高了分析物的回收率，更有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，結果重現性較好，操作簡單，省時省力。運用UPLC檢測分析，縮短了分析時間，檢測的靈敏度較高，并且儀器的專屬性強。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器有Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀配二元泵，在線脫氣機，自動進樣器，PDA檢測器;Sartorius 2202S型電子天平，Waters Oasis HLB固相萃取小柱，THERMO MEGAFGE11R高速冷凍離心機，pHB-1便攜式酸度計，THZ-92C氣浴恒溫振蕩器。

主要試劑包括金霉素標準品 (純度92.5%)，四環素標準品 (純度97.0%)，土霉素標準品 (純度89.9%)，甲醇、乙腈、三乙胺均為色譜純，磷酸、三水合乙酸鉛為分析純。

提取劑包括四環素、沙星類快速檢測前處理試劑盒 (北京六角體科技發展有限公司)。

標準儲備液。分別稱取金霉素、四環素、土霉素標準品10 mg，用甲醇溶液溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，配置成100μg·mL-1的標準儲備液。于0～4℃避光保存。

混合標準中間液。分別移取5 mL金霉素、四環素、土霉素標準儲備液于50 mL棕色容量瓶中，混合均勻，并用甲醇定容，配置成金霉素、四環素、土霉素均為10μg·mL-1的混合標準溶液，于0～4℃避光保存。

標準工作液。吸取一定量的標準中間液，用流動相稀釋至1.00 mL，配制成0.05，0.10，0.50和1.00μg·mL-1系列梯度的標準工作液。

1.2 色譜條件

色譜柱:Waters BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm，1.7μm);流動相:0.05 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液 (pH值 2.4)+乙腈 (V∶V為80∶20);流速0.3 mL·min-1;柱溫:35.0℃;檢測波長355 nm;進樣量10μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

取新鮮或冷凍的組織，去除脂肪和筋膜，魚肉、龜鱉肉去皮，蝦、蟹去殼，絞碎均質。

1.3.2 樣品提取

稱取樣品5.00 g于50 mL離心管中，分別加入不同濃度的混合標準溶液。加入提取劑10 mL，漩渦振蕩3 min，9 000 r·min-15℃冷凍離心15 min，將上清液轉移到另一支50 mL離心管中，再向樣品中加入10 mL提取劑，重復提取1遍，合并上清液。向上清液中加入0.05 g的乙酸鉛，漩渦振蕩 2 min，9 000 r·min-15℃冷凍離心15 min，取10 mL備用。

1.3.3 樣品凈化

Waters Oasis HLB固相萃取小柱依次用5 mL甲醇、5 mL提取劑活化。待活化液流至填料上層以下，加入樣品提取液以2～3 mL·min-1速度過柱，棄廢液。待樣品提取液全部流出后用5 mL蒸餾水淋洗固相萃取柱，待淋洗液全部流出后，抽真空5 min。用0.8 mL甲醇洗脫，洗脫液收集于15 mL玻璃離心管中，40℃氮氣吹干。殘渣加入1 mL流動相漩渦振蕩2 min，過0.22μm濾膜后待測。

2 結果與分析

2.1 樣品添加的回收率

土霉素回收率在80.00%～93.40%，四環素回收率在82.08%～97.60%，金霉素的回收率在69.00% ～80.96%，金霉素回收率最低 (表1)。在試驗過程中金霉素的損失較多，由于其化學性質不穩定，見光易分解，因此在有光的環境下進行試驗得到的回收率低。

2.2 方法的線性及相關系數

0.05 ，0.10，0.50，1.00 μg·mL-1系列標準工作液按濃度從低到高以1.2色譜條件分析，按所得峰面積的平均值與對應的標準溶液濃度作標準曲線，3種樣品濃度在0.05～1.00μg·mL-1的范圍內呈線性關系。

表1 不同組織樣品添加的回收率

土霉素標準曲線y=1.42 e+004 x-1.56 e+002，r=0.999 5。

四環素標準曲線y=1.83 e+004 x-2.60 e+002，r=0.998 8。

金霉素標準曲線y=2.36 e+004 x+1.41 e+002，r=0.999 9。

2.3 樣品前處理方法的優化

試驗的提取、凈化的方法根據四環素、沙星類快速檢測前處理試劑盒中動物源食品的快速測定方法來進行并優化。由于魚肉含有大量的粗蛋白，在離心機中難以較好地離心，會出現大量的渾濁液。因此，試驗中使用了9 000 r·min-15℃冷凍離心15 min，提高轉速，降低溫度，并延長離心時間，使提取液較為清透，為下一步的固相萃取奠定了良好的基礎。在上清液中加入乙酸鉛是運用酸沉法，由于四環素類抗生素在生物樣品中易與蛋白質強烈結合，因此，常用強酸或酸性脫蛋白及從生物樣中提取而起到沉淀蛋白的作用。

2.4 固相萃取柱的選擇

試驗采用Waters Oasis HLB 3 mL(60 mg)的固相萃取柱，由于HLB柱子無需經過繁瑣的過柱及蒸發濃縮過程，提取液無需調節pH值，且吸附容量高，萃取效果也好。

2.5 流動相的選擇

本試驗使用的流動相為0.05 mol·L-1磷酸/三乙胺緩沖液 (pH 值2.4)+乙腈 (80∶20，V∶V)，乙腈的洗脫能力強，能有效除去色譜柱中殘留的雜質，加入了少量的酸，是為了增加離子化效率，提高儀器的靈敏度。

2.6 檢測波長的選擇

土霉素、四環素、金霉素3種抗生素在260和355 nm 2個波長附近都有吸收峰，在260 nm附近的吸收最大，但因為雜質在短波長吸收較大，因此選擇了355 nm為3種抗生素共同的檢測波長。

3 小結

試驗采用四環素、沙星類快速檢測前處理試劑盒中的提取劑及方法，并在試驗方法上做了優化，更好地提取樣品中的有效成分，同時大大提高了的提取效率，較其他不同試劑大大縮短了時間。采用SPE凈化法，減少了樣品中的雜質對儀器產生的污染，為下一步進樣檢測制造的良好前提條件，提高了分析物的回收率，有效地將分析物與干擾組分分離，結果重現性較好，減少了樣品預處理過程，操作簡單，省時省力，使用UPLC檢測快速準確。綜上，本試驗大大縮短了試驗時間，提高了試驗結果的準確性，使檢測結果獲得了良好的回收率。

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