魷魚墨多糖改善小鼠腸粘膜免疫及作用機制的研究

左 濤，李學敏，曹 露，王靜鳳，王玉明，李兆杰，薛長湖，唐慶娟

(中國海洋大學食品科學與工程學院山東青島 266003)

腸道不僅是消化吸收的重要場所，也是生物體最大的免疫器官。腸道粘膜面積龐大，它的結構和功能構成了強大的粘膜免疫系統。腸粘膜免疫是全身免疫的一部分，其功能不僅僅作用于腸粘膜，還參與全身免疫功能的調節。分泌型IgA(SIgA)是由小腸上皮細胞分泌的免疫球蛋白，在腸道粘膜表面起到重要的免疫保護作用，用以抵抗外來微生物如細菌、病毒、寄生蟲等的入侵，是腸道免疫屏障的主要效應因子。腸道SIgA主要是通過小腸上皮細胞的pIgR(多聚免疫球蛋白受體)穿胞轉運dIgA從而分泌到細胞外的，在腸腔中 SIgA發揮粘膜防御功能［1－3］。當腸道的免疫屏障受到應激、化療藥物(如環磷酰胺)、免疫抑制劑、燒傷等內部或外界因素影響而被削弱時，輕者發生腸炎，重者甚至會危及生命［4］。因此，保護腸道粘膜免疫屏障的完整性，維持SIgA的正常分泌，對于防治腸源性感染、保護人類健康至關重要。

大量研究表明，許多多糖類物質可以明顯改善機體免疫力。但是，具有改善腸道免疫促進SIgA分泌活性的多糖類物質鮮有報道。魷魚墨主要由黑色素和富含巖藻糖的粘多糖組成，具有抗腫瘤、免疫調節、升高白細胞、抗輻射以及促凝血等多種生理活性，是一種極具應用潛力的天然資源［5］。已有報道證實，魷魚墨黑色素具有免疫調節作用［6］，而且魷魚墨粘多糖也能夠明顯改善氫化可的松所致的小鼠免疫功能低下狀況［7］。但迄今尚未見魷魚墨多糖與腸道粘膜免疫關系的報道。

北太平洋魷魚(Ommastrephes bartrami)是目前的一種主要捕撈和加工魷魚品種，在中國、日本都有較高的產量。其個體墨囊相對較大，一般一個成熟魷魚的魷魚墨囊大約占其體重的1.3%，而在其加工過程中，墨囊往往作為廢棄物丟棄，一些國家甚至為處理這些加工廢棄物投入大量的財力和物力。因此，研究魷魚墨的加工再利用具有重要的意義。本文主要研究魷魚墨多糖對免疫低下模型小鼠的腸道免疫調節作用，旨在篩選出改善腸粘膜免疫的活性成分，為魷魚墨多糖在食品、營養保健等領域的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 魷魚墨囊 北太平洋魷魚墨囊，由浙江舟山漁業公司提供，－20℃凍藏，使用時于0℃解凍。

1.2 實驗動物 健康♂Balb/c小鼠50只(體質量18－22 g)，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SCXK(京)2007－0001;

1.3 實驗試劑和儀器 試劑:氯化鈉，甲醛(10%)，磷酸二氫鈉，磷酸氫二鈉，均為國產分析純;環磷酰胺購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;膜蛋白提取試劑盒(上海生工);Mouse SIgA ELISA Kit(武漢USCNK);Mouse pIgR ELISA Kit(武漢 USCNK);Mouse IgA antibody(Bethyl Laboratories);山羊抗SABC免疫組化試劑盒(博邁德);濃縮型DAB試劑盒(Solarbio);TRIzol(Invitrogen);M-MLV逆轉錄酶(Promega);dNTP(TaKaRa);RNase inhibitor(Roche);隨機引物B0043-9(上海生工生物工程有限公司);儀器:高速臺式離心機TGL-16G(上海安亭科學儀器廠);酶標儀Model680(美國Bio RAD產品);全溫振蕩培養箱(HZQ-F)(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司);電熱恒溫水浴鍋(HHS-Ni)(北京長安科學儀器廠)，光學顯微鏡(Olympus BX41)，凝膠成像系統(Tanon GIS-2000，上海天能科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 魷魚墨粗多糖制備 魷魚墨囊解凍去皮經水浸泡過夜，超速離心后得到魷魚墨上清液。上清液經木瓜蛋白酶酶解、醇沉、丙酮洗，再經三氯乙酸除去雜蛋白，所得溶液透析后經真空冷凍干燥，得魷魚墨粗多糖樣品。粗多糖的得率約為1.5%(m/V)，粗多糖樣品中多糖含量使用苯酚－硫酸法檢測濃度為68.9%，蛋白含量使用福林－酚法檢測濃度為8.9%。

1.4.2 環磷酰胺腹腔注射液劑量的確定 通過預實驗將36只Balb/c小鼠，按體重隨機分成6組，每組6只，分別為1組正常組小鼠和5組環磷酰胺模型組小鼠。5組環磷酰胺模型組小鼠分別連續腹腔注射環磷酰胺(50 mg·kg－1)1、2、3、4、5 d，d6 脫頸椎處死小鼠。刮取腸粘膜，測定脾指數、胸腺指數和腸粘膜SIgA分泌量。實驗發現連續2 d注射環磷酰胺已造成胸腺、脾嚴重受損，SIgA分泌量也明顯下降。故確定環磷酰胺最終注射劑量與時間為:連續2 d腹腔注射環磷酰胺(50 mg·kg－1)構建機體免疫下降小鼠模型。

1.4.3 魷魚墨多糖灌胃劑量確定 通過預實驗將50只Balb/c小鼠，按體重隨機分成5組，選擇魷魚墨多糖灌胃劑量為 2 mg·kg－1、20 mg·kg－1、200 mg·kg－1，28 d灌胃飼養。于第25天開始連續兩天給予小鼠腹腔注射環磷酰胺(50 mg·kg－1)處理。第28天殺鼠刮取腸粘膜通過酶聯免疫反應試劑盒測定腸道SIgA分泌量與脾指數、胸腺指數。實驗發現各組中僅200 mg·kg－1劑量魷魚墨多糖具有明顯改善胸腺指數、脾指數與腸粘膜SIgA的功效。故將后續試驗小鼠灌胃劑量確定為50、100、200 mg·kg－1。

1.4.4 動物分組 將50只Balb/c小鼠，按體重隨機分成5組:正常對照組、模型組、低、中、高劑量組，每組10只(飼養在專門動物飼養籠內，給予清潔無菌喂養)。飼養小鼠28 d，每日給以小鼠低、中、高劑量組分別灌胃魷魚墨多糖50、100、200 mg·kg－1，正常組、模型組分別灌服同等體積的生理鹽水;并每日記錄體重;最后連續2 d，模型組、低、中、高劑量組腹腔注射環磷酰胺(50 mg·kg－1)，正常組注射等體積的無菌生理鹽水。第28天小鼠禁食不禁水12 h，脫頸椎處死小鼠檢測相關指標。

1.4.5 胸腺指數/脾指數 Balb/c小鼠于末次給藥后，禁食不禁水12 h，分別稱重，脫頸椎處死，剝離胸腺、脾臟稱重并計算胸腺/體重和脾臟/體重比值。

1.4.6 小腸組織切片及HE染色結構觀察 小鼠處死后，沿腹部正中線切開，取出靠近空腸5～10 cm片段于中性甲醛中固定。將甲醛固定的小腸組織于進行小腸石蠟包埋、組織切片制備與HE染色，中性樹膠封片。

1.4.7 小腸粘膜SIgA含量測定 沿小鼠腹部正中線切開，用鑷子與剪刀小心取出靠近十二指腸段的空腸約5 cm稱重，刮取腸粘膜，溶于2 ml PBS(pH 7.4)，于 5 000 r·min－1，5 min 離心收集上清，按mouse SIgA ELISA Kit試劑盒(武漢USCNK)說明書操作檢測單位質量小腸內SIgA含量。

1.4.8 免疫組織化學法檢測小腸固有層IgA表達量 小腸石蠟切片組織經常規脫蠟至水，0.3%甲醇過氧化氫輕搖孵育30 min以消除內源性過氧化物酶的活性，胰蛋白酶37℃ 10 min，IgA抗體4℃孵育過夜，二抗37℃孵育1 h，DAB顯色5 min，PBS終止顯色，蘇木素復染，蒸餾水1 min，脫水，中性樹膠封片，置于顯微鏡下觀察。

1.4.9 小腸pIgR含量測定 截取0.1 g小鼠空腸，經膜蛋白提取試劑盒法提取總膜蛋白，按mouse pIgR ELISA Kit試劑盒(武漢USCNK)說明書操作檢測小腸內pIgR含量。

1.4.10 RT-PCR法檢測小腸pIgR mRNA表達量截取0.1 g小鼠空腸采用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA濃度，OD260/OD280為1.8～2.0，于－80℃冰箱保存。取1 μg總RNA進行逆轉錄反應合成cDNA，并取逆轉錄產物cDNA用于PCR擴增，以β-actin的表達量為內參。β-actin上游引物:5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，下游引物:5'-ATGTCACGCACGATTTCCC-3';pIgR上游引物5'-CAGACATTAGCATGGCAGACTTCAA-3'，下 游 引物5'-TGCCGAGTAGGCCATGTCAG-3';PCR條件:94℃ 2 min;變性、退火、延伸各為 94℃ 30 s、53℃30 s、72℃ 1 min，重復23個循環，最后72℃延伸5 min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠(EB+)中電泳，紫外光(300 nm)觀察并照相記錄，用Image J軟件進行灰度掃描比對。

2 結果

2.1 小鼠體重變化 小鼠飼養結束時，模型組和魷魚墨多糖各劑量組小鼠的平均體重均低于正常組，差異有顯著性(P＜0.05)(Fig 1)。在未注射環磷酰胺之前，各組小鼠體重均處于緩慢上升趨勢，但從第25天腹腔注射環磷酰胺之后，模型組和魷魚墨多糖劑量組小鼠體重逐漸下降(Fig 1)，但各劑量組小鼠體重均高于環磷酰胺模型組小鼠。環磷酰胺作為一種烷化劑類化療藥物，對快速增殖的細胞具有損傷作用。腸道上皮細胞增殖迅速，容易受到環磷酰胺的損傷。本研究中注射環磷酰胺小鼠的體重均下降，提示環磷酰胺對小鼠腸道具有損傷作用。魷魚墨多糖有改善小鼠體重的趨勢，提示魷魚墨多糖對腸道損傷具有一定的修復作用。

Fig 1 Change of mouse bodyweight

2.2 脾指數/胸腺指數 胸腺和脾臟是重要的免疫器官，胸腺的主要功能是產生T淋巴細胞和分泌胸腺素，主要參與細胞免疫;脾臟中有豐富的淋巴細胞和巨噬細胞，B淋巴細胞比例較大，因此與體液免疫關系更為密切。其重量與其功能以及其中免疫細胞數量有關。所以臟器指數可在一定程度上反映機體免疫功能的強弱。研究中環磷酰胺模型組小鼠的胸腺指數與脾指數均低于正常組小鼠并有差異顯著性(P＜0.01)，而且魷魚墨多糖可明顯提高環磷酰胺所致免疫低下小鼠的脾指數、胸腺指數(Fig 2)。雖然魷魚墨多糖劑量組小鼠脾指數與胸腺指數均未達到正常水平，但是與模型對照組相比，低、中、高劑量組的脾指數分別提高了12.7%、13.1%、15.6%，胸腺指數分別提高了53.5%、67.6%、61.8%，差異均有顯著性(P＜0.05)。由此提示，魷魚墨粗多糖可以改善免疫低下小鼠的免疫功能。

Fig 2 Effects of Squid Ink glycosaminoglycan on immune function in immunosuppressed mice

2.3 腸粘膜的結構完整性 環磷酰胺可以導致機體免疫低下，而增殖更新較快的腸道作為機體最大的免疫器官易受化療藥物環磷酰胺的損傷。小腸組織切片HE染色觀察小腸粘膜結構(Fig 3)，結果提示連續2 d注射環磷酰胺(50 mg·kg－1)后，小腸絨毛的完整性與形態結構未有明顯變化。小腸絨毛的上皮細胞排列、固有層結構、腸隱窩結構等均未有明顯變化。且模型組小鼠和魷魚墨劑量組小鼠中均未出現上皮細胞明顯病理損傷、炎癥浸潤、白細胞穿越進入固有層等現象。說明此劑量的環磷酰胺注射小鼠并未引起腸道明顯病理反應。

2.4 腸粘膜SIgA含量 雖然連續2 d注射環磷酰胺(50 mg·kg－1)并未引起腸道明顯生理結構變化，但腸粘膜免疫功能亦與腸道許多免疫因子，如獲得性免疫因子SIgA有重要關系。因此在研究中我們進一步探討了環磷酰胺與魷魚墨多糖對腸粘膜SIgA的影響。通過單位質量小腸內腸粘膜SIgA的含量比較研究(Tab 1)可以看出，模型組小鼠腸道SIgA的含量明顯低于正常組(P＜0.01)，作為腸道免疫屏障重要效應因子的SIgA分泌量明顯降低說明腸道抵抗外來微生物的能力及腸道粘膜的免疫保護作用明顯下降，提示環磷酰胺可以造成腸粘膜SI-gA損傷。與模型組相比，魷魚墨多糖低、中、高劑量組小鼠SIgA的含量均明顯高于模型組(P＜0.05)，說明魷魚墨多糖對腸粘膜損傷小鼠的SIgA分泌具有改善作用，并且這種改善作用具有劑量依賴性。

Tab 1 Comparison of SIgA content in mouse small intestine

2.5 小腸固有層IgA的表達量 SIgA的分泌主要依賴于分泌IgA的漿細胞，以及表達pIgR的上皮細胞轉運功能。為了探討魷魚墨多糖促進腸道SIgA分泌的作用機制，本研究對小鼠腸道IgA和pIgR的表達量進行了研究。

免疫組織化學染色結果顯示(Fig 4):相比正常組，模型組小鼠小腸固有層的IgA染色明顯較淺，表明環磷酰胺會造成腸粘膜IgA的表達量減少。與模型組相比，魷魚墨粗多糖低劑量組表達量有明顯變化，且中、高劑量組的小腸固有層IgA明顯染色較深，高劑量組IgA染色尤為深。結果表明，北太平洋魷魚墨多糖可以改善小腸固有層IgA的表達受損情況，并且呈劑量依賴性。

2.6 腸pIgR mRNA與蛋白質表達量 小腸上皮細胞為腸道粘膜免疫的重要物理屏障，在其基底膜側表達的pIgR負責轉運固有層IgA并形成SIgA，以發揮免疫清除腸道有害因子的作用。為了探究魷魚墨多糖改善腸粘膜SIgA的功效，是否與促進pIgR的表達有關，本研究對pIgR的mRNA與蛋白質表達量進行了檢測。小腸pIgR的RT-PCR結果(Fig 5)提示:環磷酰胺與魷魚墨粗多糖對小鼠小腸上皮細胞pIgR的mRNA表達量影響不大。pIgR的蛋白表達量結果(Fig 6)與mRNA表達量基本相似，環磷酰胺與魷魚墨多糖對小鼠小腸上皮細胞pIgR的蛋白表達量影響不大，但魷魚墨高劑量組的pIgR蛋白表達量明顯增高(P＜0.05)。

體外純化蛋白和細胞與組織表達蛋白的相關研究表明，人、牛、大鼠、小鼠和兔的pIgR均是高度N－糖基化的，分子中大約有15% ～24%碳水化合物［2］。在高劑量組小鼠中，小腸上皮細胞pIgR的表達在轉錄水平mRNA上沒有變化而蛋白質水平上卻有明顯提高。這可能與魷魚墨多糖影響pIgR的轉錄后調控如糖基化等過程有關。高劑量魷魚墨多糖促使pIgR高表達，提示魷魚墨多糖對上皮細胞功能具有改善作用。另外，pIgR高表達時，經上皮細胞轉運并剪切后在腸腔內形成的分泌片(secretory component，SC)也增多，可以發揮更強的抑制腸道有害菌的作用。

Fig 3 Photographs of small intestine by HE staining

Fig 4 Photographs of IgA expression of small intestine by immunohistochemistry staining

Fig 5 Relative mRNA expression of pIgR in mouse intestine

Fig 6 Expression of pIgR in mouse intestine

3 討論

腸粘膜表面存在大量的微生物，通常外環境中的大部分病原體進入胃腸道后，會被粘膜天然免疫成分形成的屏障阻止在體外。而腸道分泌的SIgA是腸粘膜免疫的重要免疫屏障，其主要功能是阻抑細菌、病毒等病原體的粘附，使之不能在腸粘膜表面定植并繁殖，從而防止感染的發生［8］。化療藥物、糖皮質激素、嚴重燙傷、吸煙等因素，都可以導致腸粘膜SIgA的減少［9－10］。當機體SIgA分泌能力下降時，會引起腸道菌群的失調、菌群移位、消化吸收障礙等，甚至還會引起腸炎和腸源性全身感染等情況。此外，臨床上出現部分患者在血清中存在抗食物蛋白的抗體和超敏反應發生率的增加，這與SIgA的分泌下降不能有效阻止食物性抗原經腸道入侵有關［11］。因此，尋找促進腸道SIgA分泌的活性物質具有重要意義。

環磷酰胺是一種抗腫瘤的化療藥物，可以導致免疫低下，引起腸道SIgA的減少，適于構建SIgA減少的動物模型。食物和中藥首先接觸的是胃腸道粘膜免疫，而且幾乎沒有毒性，成為尋找促進SIgA活性物質的重要來源。已有報道指出:中藥四君子湯復方的多糖能使環磷酰胺誘導小鼠的腸粘膜中IgA+細胞數量增加［12］;海帶多糖能夠明顯提高小鼠腸粘膜組織中 SIgA含量，并呈劑量依賴效應［13］。魷魚墨多糖具有改善免疫功能低下的作用［7］，但是對改善腸粘膜SIgA方面的活性尚未見報道。

本研究的結果顯示，北太平洋魷魚墨多糖可以明顯改善環磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的胸腺指數和脾指數，初步證實了魷魚墨多糖對小鼠具有免疫增強作用。另外，北太平洋魷魚墨多糖可以明顯改善小鼠腸道SIgA的分泌，提示其對腸道獲得性免疫具有改善作用，并且呈劑量依賴關系。腸道SIgA的生成依賴于兩種細胞:分泌IgA和J鏈的漿細胞，以及表達pIgR的腸上皮細胞。本研究結果表明，魷魚墨多糖可明顯促進小鼠腸道SIgA分泌，這與其促進漿細胞分泌IgA增多和促進上皮細胞表達pIgR相關。小鼠腸道固有層IgA表達量增多，上皮細胞pIgR穿胞轉運dIgA含量隨之增加，因此分泌到腸腔中的SIgA含量亦會增加而使腸道粘膜防御功能增強。其中魷魚墨多糖高劑量組小鼠SIgA的明顯升高(P＜0.01)可能還與魷魚墨多糖促進上皮細胞pIgR表達量增高有關。本研究為魷魚墨多糖在食品、營養保健等領域的實際應用提供了一定的理論依據。

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