酸敏感離子通道1a在酸誘導的大鼠關節軟骨細胞自噬的作用及其機制研究

張晨晨，唐 杰，胡 偉，葛金芳，林梅英，陳飛虎

(1.安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032;2.安徽醫科大學第二附屬醫院藥劑科，安徽合肥 230601)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，慢性多關節炎癥為其主要臨床表現。研究表明RA關節局部組織酸化導致的關節軟骨和骨質的破壞是RA致殘的主要原因［1－2］，積極尋找導致關節軟骨破壞及骨組織病理生理改變的關鍵環節并以此為靶點開發新型治療藥物成為該病的研究熱點和重點。

酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels，ASICs)是一類由細胞外H+直接激活的陽離子通道，屬于 ENaC(epithelial Na+channel)/DEG(degenerin)超家族。當胞外pH降低時，開放的通道對Na+、Ca2+具有通透性，進而引起細胞一系列生理病理變化［3］。本課題組前期研究證實ASIC1a在模擬RA發病歷程的大鼠佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)關節軟骨上有較強表達，抑制ASICs，尤其是ASIC1a的表達可抑制胞外酸化誘導的軟骨細胞凋亡，對關節軟骨具有保護作用［4－5］。提示 ASIC1a在組織酸化導致的軟骨細胞損傷中發揮作用，但具體機制不清。

自噬和凋亡是細胞在炎癥等不良刺激下的主要應激反應形式。文獻報道［6］，RA患者關節軟骨細胞的自噬過度激活在關節破壞中發揮重要作用。本研究以大鼠原代軟骨細胞為研究對象，采用胞外酸化模擬AA大鼠關節滑液環境，研究ASIC1a是否在酸化誘導的軟骨細胞自噬中發揮作用及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠25只，♂，體質量180～200 g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，合格證號:皖動準字01號。實驗室溫度控制在20℃ ～25℃，濕度在50% ～60%，自由飲水。

1.2 藥物和試劑 Amiloride，Sigma公司產品;PcTX1，Alomone公司產品;PD98059和 SB203580，Tocris Bioscience公司產品;抗LC3抗體購自Sigma公司;抗ERK1/2抗體、抗p38MAPK抗體購自Cell Signaling Technology公司;抗 pERK1/2抗體、抗 pp38MAPK抗體購自CST公司;Ⅱ型膠原酶，美國Sigma公司產品，臨用時現配;胰蛋白酶，高糖DMEM液體培養基為Hyclone公司產品;胎牛血清，Gibco公司產品;D-Hanks溶液，碧云天公司產品;Alcian染液試劑盒，瑞士Fluka公司產品;TRIzol試劑，美國Invitrogen公司產品;逆轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒，立陶宛Fermentas公司產品;ECL顯色試劑盒，Thermo Scientific公司產品。

1.3 大鼠關節軟骨細胞分離、培養、鑒定 按本實驗室常規方法進行大鼠關節軟骨細胞的分離與培養［5］，采用 Alcian染色法進行關節軟骨細胞的鑒定，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4 軟骨細胞自噬的誘導及藥物處理

1.4.1 將軟骨細胞分別在 pH 為 7.4、7.0、6.5、6.0、5.5不同的胞外環境下培養3 h，觀察細胞自噬情況，建立關節軟骨細胞自噬體外模型。

1.4.2 將軟骨細胞分組如下:pH 7.4正常組、pH 6.0 組、pH 6.0+Amiloride 組(100 μmol·L－1)、pH 6.0+PcTX1 組(100 μg·L－1)。各組于給藥30 min后，加入pH 6.0的培養基共培養3 h，收集細胞檢測ASIC1a活化后，酸化誘導的軟骨細胞自噬及ERK1/2、p38MAPK蛋白磷酸化水平的變化及抑制ASIC1a的表達對上述指標的影響。

1.4.3 將軟骨細胞分為pH 7.4正常組，pH 6.0酸化組，pH 6.0+PcTX1組，以及經 ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制劑(PD98059、SB203580)處理的酸化組。各組于給藥30 min后，加入pH 6.0的培養基共培養3 h，收集細胞檢測 ERK1/2及 p38MAPK在ASIC1a調控大鼠關節軟骨細胞自噬中的作用。

1.5 半定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測軟骨細胞自噬基因Beclin-1 mRNA表達 將1×106個細胞接種于培養瓶中，實驗分組同1.4.2、1.4.3。按 TRIzol一步法提取細胞總 RNA，以紫外分光光度計測RNA含量和純度(RNA在260 nm和280 nm的光密度比值為1.8～2.0之間)，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性(28S和18S RNA條帶比值I＞2.0)。用5 μg總RNA為模板，逆轉錄成cDNA。按RT-PCR試劑盒說明書進行擴增反應，用β-actin為內標。根據基因Gene bank提供的Beclin-1和β-actin序列，由上海生工生物有限公司合成引物，Beclin-1的序列為:Forward primer:5'-GGAGATGTTGGAGCAAATGAA-3'，Reverse primer:5'-GTCGCATTGAAGACATTGGTT-3'，PCR反應產物長度為321bp。β-actin的序列為:Forward primer:5'-ACCACAGCTGAGGGAAATCG-3'，Reverse primer:5'-AGA GGTCTTTACGGATGTCAACG-3'，PCR反應產物長度為345 bp。Beclin-1、β-actin反應條件:預變性94℃5 min;變性 94℃ 40 s;退火 51℃ 40 s;延伸 72℃1 min;35個循環后72℃延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結果用凝膠自動成像2 000系統掃描，取其分值作為量化指標，以特異性基因條帶與β-actin基因條帶的密度比值表示不同樣本間的相對量。以3次實驗結果的均值做統計學分析。

1.6 Weston blot檢測自噬蛋白LC3的表達 將軟骨細胞消化，以1×106個細胞接種于培養瓶中，實驗分組同“1.4”。加入pH 6.0的培養基培養3 h后，棄培養液，用預冷PBS洗滌3遍，每瓶加入400 μl RIPA裂解液(含10%PMSF)裂解30 min，用細胞刮將細胞轉移到1.5 ml EP管中，離心取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將上清與上樣緩沖液按4∶1的比例進行分裝，100℃煮10 min變性，－80℃保存待用。等量的蛋白樣品進行SDS-PAGE，將電泳分離的蛋白轉移到PVDF膜上。TBST洗膜10 min。室溫下用含5%脫脂奶粉(TBST溶解)封閉3 h。隨后加入一抗(1∶500)4℃孵育過夜。TBST洗脫4次，加入相應的二抗，孵育1 h，漂洗4次。將PVDF膜用化學發光劑ECL染1 min，暗室中曝光到X線片上。結果采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統分析。

1.7 透射電子顯微鏡法觀察自噬小體數量的變化將軟骨細胞以1×106個接種于細胞培養瓶中，實驗分組同“1.4.2”。待細胞貼壁后，將培養的軟骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化后進行收集，4℃，1 200 r·min－1離心5 min成肉眼可見的細胞團塊，棄去上清液，加入 PBS洗1次后進行離心4℃，1 200 r·min－15 min。先用預冷的2.5%戊二醛4℃固定2 h，在經緩沖液多次清洗后，用1%的鋨酸在4℃下后固定1.5 h。經梯度丙酮脫水(先90%丙酮一次15 min，后100%丙酮3次每次10 min)，采用環氧樹脂618 60%浸透包埋，樣品包埋后進入烤箱進行聚合，經過 37℃(16 h)、45℃(12 h)、60℃(14 h)聚合變硬后，用溫水將膠囊殼去除，擦凈包埋塊，備切片使用。超薄切片機切片，染色后電子透射電鏡觀察。

2 結果

2.1 軟骨細胞形態觀察及鑒定 剛分離的原代大鼠關節軟骨細胞呈圓球形，懸浮狀態(Fig 1a)，培養24 h后，一些細胞開始貼壁，伸展形成突起(Fig 1b)，培養72 h后細胞貼壁較多，成簇生長，逐漸伸展為多角形并連接成片(Fig 1c)，軟骨細胞經愛先藍染液鑒定顯示細胞分泌蛋白多糖呈藍色，胞核部分呈清晰的紅色，細胞呈梭形鋪路石狀排列(Fig 1d)。

Fig 1 Morphological observation of the articular chondrocytes(×200)

2.2 胞外酸化對體外培養的軟骨細胞自噬的活化作用 不同pH的胞外環境對軟骨細胞自噬的影響與酸性程度成正相關，如圖所示，與pH 7.4正常組相比，軟骨細胞自噬蛋白LC3表達量隨胞外酸化程度的增加而升高。其中 pH 6.0、pH 5.5組與pH 7.4組相比差異有統計學意義(Fig 2)，且這兩組之間LC3表達量基本一致，本實驗中選取pH 6.0為胞外酸化條件。

2.3 ASIC1a對酸誘導的大鼠關節軟骨細胞自噬的影響

2.3.1 ASIC1a對大鼠關節軟骨細胞Beclin-1 mRNA表達的影響 結果如圖所示，與正常組相比，酸化刺激組大鼠關節軟骨細胞Beclin-1 mRNA表達明顯增加，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組可抑制大鼠關節軟骨細胞Beclin-1 mRNA表達(Fig 3)。

2.3.2 ASIC1a對大鼠關節軟骨細胞LC3蛋白表達的影響 Western blot結果顯示，與pH 7.4組相比，酸化組大鼠軟骨細胞LC3蛋白表達明顯增加，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組可抑制大鼠關節軟骨細胞LC3蛋白表達(Fig 4)。

M:DNA marker;1:Control;2:pH 6.0 group;3:pH 6.0+Amiloride group;4:pH 6.0+PcTX1 group.＊＊ P＜ 0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs pH 6.0 group

2.3.3 ASIC1a對大鼠關節軟骨細胞自噬小體數量的影響 采用透射電子顯微鏡法觀察各組細胞自噬小體數量的變化。如圖所示，正常組軟骨細胞胞質中可見較完整的細胞器結構，且形態規則(Fig 5a)，與pH 7.4組相比，酸化組軟骨細胞胞質中出現較多的由雙層膜包裹的細胞自噬小體(Fig 5b)，與酸化刺激組比較，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組胞質中自噬小體的數量明顯減少，細胞器形態趨于正常(Fig 5d)。

Fig 4 Effect of ASIC1a on protein expression of LC3 in acid-induced chondrocytes(±s，n=3)

Fig 5 Representative ultrastructural morphology of autophagy(×20 000)

2.4 ASIC1a對酸化的大鼠關節軟骨細胞ERK1/2和p38MAPK蛋白磷酸化的影響 Western blot結果如圖所示，與pH 7.4組比較，酸化刺激組大鼠關節軟骨細胞ERK1/2、p38MAPK磷酸化蛋白表達均明顯增加，且差異有統計學意義(P＜0.01)。與酸化組相比，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1組可抑制ERK1/2及p38MAPK磷酸化蛋白表達(Fig 6)。

Fig 6 Effects of acid-sensing ion channel 1a on phosphorylation of ERK1/2 and p38 in acid-induced articular chondrocytes( ± s，n=3)

2.5 ERK1/2、p38MAPK 在 ASIC1a調控大鼠關節軟骨細胞自噬中的作用

2.5.1 ERK1/2、p38MAPK 對大鼠關節軟骨細胞Beclin-1 mRNA表達的影響 RT-PCR法檢測結果如圖所示，與pH 7.4正常組比較，酸化組Beclin-1 mRNA表達量升高，且差異具有顯著性(P＜0.01)。與酸化組比較，ASIC1a特異性阻滯劑 PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059預處理組抑制Beclin-1 mRNA表達。而與酸化組比較，p38MAPK抑制劑SB203580未明顯改變大鼠關節軟骨細胞Beclin-1 mRNA表達(Fig 7)。

2.5.2 ERK1/2、p38MAPK 對大鼠關節軟骨細胞LC3蛋白表達的影響 Westernblot結果顯示，與pH 7.4正常組比較，酸化組LC3蛋白表達量升高。ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059預處理組與酸化組相比LC3蛋白表達量降低，而p38MAPK抑制劑SB203580組LC3蛋白表達量沒有明顯改變(Fig 8)。

Fig 7 Effect of inhibitor of phosphorylated ERK1/2 and p38MAPK on mRNA expression of Beclin-1(±s，n=3)

3 討論

細胞自噬(autophagy)是一種溶酶體依賴性的細胞內多余大分子物質和受損細胞器降解的過程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細胞環境穩定。過度的自噬可以導致細胞的程序性死亡，稱為Ⅱ型程序性細胞死亡［7］。研究表明［8－9］，自噬水平的異常與神經退行性疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的發展有關。饑餓、缺氧和胞外酸化是誘發自噬活化的主要原因。組織酸化性疾病RA患者關節軟骨上也存在有自噬的激活并在關節破壞中發揮重要作用［6］，但具體機制尚不清楚。

軟骨細胞自噬和細胞凋亡的失衡是參與關節軟骨損傷的主要形式［10］。本課題組前期研究已證實，AA大鼠關節軟骨的酸化刺激可誘導ASIC1a激活繼而誘發關節軟骨損傷，抑制ASIC1a的表達能保護因酸化導致的軟骨細胞損傷。但對于ASIC1a在自噬中的作用尚不清楚。本研究首先采用胞外不同pH刺激，觀察大鼠關節軟骨細胞的自噬情況。結果表明，pH6.0和pH5.5均能明顯激活軟骨細胞自噬，表現為自噬標志性蛋白LC3的表達升高，但pH 6.0和pH 5.5條件下差異無顯著性。在此基礎上，本研究選擇pH 6.0為胞外酸化條件，使用 ASIC1a非特異性和特異性阻滯劑，觀察了ASIC1a在酸化誘導的軟骨細胞自噬中的作用。結果表明，抑制ASIC1a的表達后自噬基因Beclin-1和自噬蛋白LC3表達均明顯降低。透射電鏡結果證實細胞自噬小體數量的變化與上述結果一致。提示抑制ASIC1a的激活參與酸化誘導的關節軟骨細胞自噬。

Fig 8 Effect of inhibitor of phosphorylated ERK1/2 andp38MAPK on protein expression of LC3(±s，n=3)

MAPK信號通路在細胞功能性調控上起重要作用，眾多研究表明，它參與細胞生長、分化、凋亡和自噬［11］。Ca2+作為細胞內的第二信使在信號轉導中有極其重要的作用，幾乎參與了人體生命的所有活動功能。持續升高的胞質內Ca2+可以激活ERK1/2和p38MAPK信號通路。ASIC1a屬于鈣滲透性酸敏感離子通道，胞外酸化激活可介導ASIC1a通道開放、胞外Ca2內流引發一系列生物學效應［12－13］。本研究結果表明，酸化刺激后大鼠關節軟骨細胞磷酸化狀態的ERK1/2和p38MAPK表達明顯增強，阻斷ASIC1a可抑制酸化刺激導致的軟骨細胞ERK1/2、p38MAPK磷酸化水平升高，提示 ERK1/2和p38MAPK蛋白參與了ASIC1a介導的大鼠關節軟骨細胞信號傳導。進一步采用ERK1/2、p38MAPK磷酸化抑制劑，觀察它們在酸化刺激誘導軟骨細胞自噬中的作用。結果表明，ASIC1a特異性阻滯劑PcTX1、ERK1/2磷酸化抑制劑PD98059均可明顯降低細胞 Beclin-1 mRNA和LC3蛋白表達。然而，p38MAPK磷酸化抑制劑SB203580組軟骨細胞的自噬水平則無明顯改變，提示ERK1/2參與了酸化刺激誘導ASIC1a激活繼而引發大鼠關節軟骨細胞的自噬過程，這與文獻報道的ERK1/2參與自噬過程的信號調控［14］的結果相一致。

綜上所述，本研究證實胞外酸化刺激可激活關節軟骨細胞自噬，阻斷大鼠關節軟骨細胞ASIC1a的表達可有效減輕酸化刺激誘導的軟骨細胞自噬，其機制可能與阻斷ASIC1a抑制ERK1/2磷酸化有關，這將為研究與酸化相關的關節疾病中類風濕關節炎的發病機制提供了新的視角。然而，本研究僅僅觀察了體外酸化環境下ASIC1a在軟骨細胞自噬激活與軟骨破壞中的作用，對于其在RA病程中各個時期的具體作用尚不清楚，有待于我們在以后的研究中采取整體實驗繼續探索。

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