硫化氫對動脈粥樣硬化膽固醇代謝的調節作用

周 紅，梁小燕，吳志遠，戚曉紅

(南京醫科大學基礎醫學院1.實驗教學中心、2.病理生理學系，江蘇南京 210029;3.新加坡國立大學醫學院藥理學系，新加坡 117597)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是以動脈內膜下脂質沉積、平滑肌細胞和膠原增殖、泡沫細胞形成為主要特征的廣泛性動脈病變［1］。高膽固醇血癥被認為是導致AS的關鍵因素，尋找有效的調節體內膽固醇代謝的藥物治療動脈粥樣硬化也因此成為這一領域的研究熱點［2］。研究顯示，硫化氫(hydrogen sulphide，H2S)作為第三種氣體信號分子，具有抗炎［3］、抗氧化［4］作用，能抑制細胞黏附分子的表達［5］，阻止巨噬細胞轉化為泡沫細胞［6］，抑制氧化型低密度脂蛋白的表達［7］。因此，H2S被認為具有潛在的抗AS作用。然而，H2S是否對脂代謝產生影響還不清楚。本課題通過建立大鼠AS模型，研究H2S對膽固醇代謝的影響，進一步探討其抗AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康♂ SD大鼠24只，清潔級，體質量(250±10)g，購于江蘇省實驗動物中心。隨機分為3組:對照組(CG)、模型組(MG)和模型+硫氫化鈉組(NaHS)，每組8只。實驗前，將動物置于實驗環境適應7 d。室溫(22±2)℃，12 h光照/12 h黑暗，動物自由取食和飲水。

1.2 藥品和試劑 NaHS、油紅O、對苯二胺硫酸鹽購于Sigma公司，膽固醇、膽酸鈉、丙基硫氧嘧啶購于上海藍季科技發展有限公司，維生素D3(Vit D3)購于上海通用藥業股份有限公司(批號:090903)，TRIzol購于Invitrogen，RT-PCR試劑盒購于TaKaRa公司，引物由上海生工合成，余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 Thermo PCR儀，Leica冰凍切片機，日立7600-020全自動生化分析儀，Nikon光學顯微鏡，美國SONICS超聲粉碎儀。

1.4 模型制備與給藥方法 采用高脂飼料加Vit D3方法復制大鼠動脈粥樣硬化模型。模型組和硫氫化鈉組給予高脂飼料(標準飼料配方中加2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%豬油、5%白糖、0.2%丙基硫氧嘧啶)，于喂養前和喂養后第3、6、9周腹腔注射Vit D3(3×105IU·kg－1)各1次。同時硫氫化鈉組每日腹腔注射 NaHS 56 μmol·kg－1，連續給藥 12周。對照組給予普通飼料及腹腔注射生理鹽水。

1.5 標本采集 各組動物于喂養前眼眶取血。模型制備完成后，頸總動脈插管取血，3 000 r·min－1離心10 min，分離血清，－80℃保存備用。新鮮肝組織一部分經液氮后－80℃保存，一部分甲醛固定，用于冰凍切片。

1.6 血脂檢測 取血清上樣于日立全自動生化分析儀檢測血總膽固醇(total cholestorol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholestorol，HDL-Ch)和低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholestorol，LDL-Ch)。1.7 組織學染色 油紅O染色:冰凍切片厚10 μm，加入油紅O染色液，避光染色60 min，60%異丙醇分化數秒，水洗，蘇木精染5～10 s，1%鹽水酒精分化1～2 s，自來水洗10 min，風干后明膠甘油封片。

1.8 肝組織膽固醇水平檢測 按文獻［8］方法取大鼠肝組織勻漿，經氯仿 ∶甲醇(2∶1)稀釋、振蕩過夜、4 500 r·min－1離心 10 min、通風櫥風干、叔丁醇/叔丁基乙醇X-114/甲醇混合液溶解后，全自動生化分析儀測定TG含量。

1.9 HepG2細胞培養 HepG2細胞株培養于含10%胎牛血清、1%雙抗(鏈霉素和青霉素)的DMEM培養基中。于5%CO237℃的培養箱內培養，2～3 d更換1次培養液。取對數生長期的細胞用于實驗。NaHS 100 μmol·L－1作用于 HepG2 細胞6 h［5］后用于檢測羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(hydroxy-methyl-glutarylcoenzyme A Reductase，HMGCoA Reductase)和低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)。

1.10 RT-PCR HepG2細胞用滅菌PBS沖洗兩次后，按常規方法提取總RNA，并用核酸蛋白測定儀測量RNA濃度及純度，A260/280比值1.8～2.0。逆轉錄按試劑盒說明操作。HMGCoA Reductase引物序列為:正義鏈5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'，反義鏈5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3';LDLR引物序列為:正義鏈 5'-CAATGTCTCACCAAGC TCTG-3'，反義鏈 5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3';內參 GAPDH正義鏈5'-CCCATCACCATCTTCC AG-3'，反 義 鏈 5'-ATGACCTTGCCCACAGCC-3'。PCR 反應條件為:98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 1 min，30個循環。將PCR產物加樣于2%瓊脂糖凝膠中，電泳后在凝膠成像分析系統中分析目的基因產物條帶的灰度值與內參PCR產物條帶的比值。

2 結果

2.1 血清血脂水平 血清TC、TG、HDL-Ch和LDLCh含量在喂養前各組間無變化(Tab 1)。喂養12周后，模型組血清TC和LDL-Ch較對照組明顯升高(P＜0.01)，HDL-Ch亦升高(P＜0.05);NaHS組血清各指標較模型組降低(P＜0.05)。

Tab 1Lipid levels in blood serum(mmol·L－1，±s，n=8)

Tab 1Lipid levels in blood serum(mmol·L－1，±s，n=8)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs model group

3 months before 3 months after CG MG NaHS TC 2.58±0.24 2.17 ±0.23 2.36±0.31 2.03±0.49 8.49±3.84＊＊ 6.20±3.21 CG MG NaHS#TG 0.83±0.17 0.75 ±0.23 0.73±0.15 1.17±0.50 1.38±0.96 0.47±0.22#HDL-Ch 1.64±0.18 1.41 ±0.15 1.56±0.22 1.12±0.13 1.88±0.68* 1.44±0.28#LDL-Ch 0.62±0.09 0.66 ±0.06 0.67±0.13 0.55±0.09 5.73±2.9＊＊ 3.63±2.92#

2.2 肝組織膽固醇水平 喂養12周后，對照組大鼠肝臟膽固醇含量為每克肝組織(1.65±0.21)mg;模型組為(4.74±0.58)mg，較對照組明顯增高(P＜0.01);模型+NaHS組為每克肝組織(3.91±0.40)mg，較模型組降低，差異有顯著性(P＜0.01)。

2.3 肝油紅O染色 肝油紅O染色顯示(Fig 1)，與對照組比，模型組肝細胞內紅色脂滴明顯增多，NaHS組明顯改善，僅有輕微脂質。

2.4 HepG2 細胞內 HMGCoA Reductase、LDLR mRNA 的表達 100 μmol·L－1NaHS作用于HepG2細胞6 h后，HMGCoA R的mRNA表達較對照組下降(Fig 2A)，差異有顯著性(P＜0.01);而LDLR mRNA的表達較對照組升高(Fig 2B)，差異有顯著性(P＜0.05)。

3 討論

Fig 1 Oil red O staining of hepatic tissues(×100)

Fig 2 Expression of HMG CoA reductase and LDL receptor in HepG2 cells(n=8)

關于H2S對AS的作用已有報道。Wang等［5］研究發現，抑制內源性H2S的產生，可使ApoE敲除鼠動脈粥樣硬化斑塊增多，而外源性H2S可以緩解AS的病程。有報道H2S對AS有明顯保護作用，并能明顯下調血脂水平［9］，但其具體機制及作用環節尚不清楚。本實驗通過對AS模型大鼠和肝HepG2細胞給予外源性H2S，觀察其對膽固醇代謝的影響，并探究其作用機制。本實驗結果顯示，H2S能降低AS大鼠血清TC、LDL-Ch水平和肝臟TC含量，提示H2S對膽固醇的代謝有一定作用。

人體膽固醇代謝受到膽固醇合成與吸收的雙重調節，其來源有兩種途徑:一種是在關鍵限速酶HMGCoA Reductase作用下，由 3-甲基-3，5-二羥基戊酸合成乙酰輔酶A，再完成內源性膽固醇生物合成;另外一種途徑是外源性的，食物中的膽固醇被小腸上皮細胞吸收后和LDL結合形成復合體，通過和肝細胞膜上豐富的LDL受體結合，完成膽固醇的細胞內吞噬作用。

HMGCoA Reductase是膽固醇合成的限速酶，各種因素對膽固醇合成的調節主要是通過對HMGCoA Reductase活性的影響來實現的［10］。為了探究H2S調節膽固醇合成代謝的機制，我們首先觀察了H2S對肝HepG2細胞HMGCoA Reductase的影響。結果顯示，H2S能降低HepG2細胞中HMGCoA Reductase mRNA的表達，提示H2S能在轉錄水平抑制HMGCoA Reductase活性，繼而抑制細胞內膽固醇的合成。

膽固醇在體內代謝的主要去路是在肝細胞中轉化成膽汁酸。血液中70%的膽固醇由LDL和極低密度脂蛋白(VLDL)攜帶，其中90%LDL是通過LDLR途徑清除的，肝臟是受體介導的LDL-Ch清除發生的主要場所，約50%的LDL在肝降解。LDLR是一種跨膜糖蛋白，在維持血漿膽固醇水平恒定中發揮重要作用［11］，主要功能是參與LDL的分解代謝，可介導血中2/3的LDL進入肝細胞降解。當LDLR數量減少、結構及功能異常時，血漿膽固醇水平增高，并在組織內過度淤積，最終導致AS斑塊形成。

為了探究H2S對膽固醇分解代謝的影響，我們進一步觀察了H2S對肝HepG2細胞LDLR的作用。實驗發現，H2S能使HepG2細胞中LDLR mRNA的表達增加，提示H2S能增加肝LDLR表達，有助于清除血液中的LDL，降低血液LDL水平。

綜上，研究結果顯示H2S對AS膽固醇代謝具有調節作用，能抑制肝HMGCoA Reductase表達，使內源性膽固醇合成下降;并上調肝臟LDLR表達，促進膽固醇在肝細胞內的轉化，從而降低血漿總膽固醇水平。但H2S影響膽固醇代謝的信號通路和具體的作用環節尚需進一步研究。

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