川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1細胞的增殖和分化影響

陳小宇，祝愛珍，劉成成，朱錦燦，劉革修

(暨南大學血液病研究所，廣東廣州 510632)

川續斷屬于川續斷科川續斷屬，是一種多年生草本植物，主要生長于潮濕的山地。續斷是川續斷的干燥根提取物，在傳統中醫學中有滋補、抗骨質疏松、抗衰老等的功效，能夠治療腰背痛、外傷血腫、先兆流產和骨折等疾病［1］。Li等［2］研究表明川續斷皂苷Ⅵ能夠通過激活PI3K/Akt通路抑制缺氧條件下心肌細胞的凋亡，Niu等［3］也通過研究證實了川續斷皂苷Ⅵ能夠激活p38和ERK1/2活性促進成骨細胞增殖和分化，并且川續斷皂苷Ⅵ具有促進大鼠體外間充質干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)向成骨細胞增殖和分化的作用［4］。成骨細胞、軟骨細胞由MSCs分化而來，MSC在適宜條件下還可以誘導分化為脂肪細胞。機體內成脂分化和成骨分化是相互制約、相互平衡的過程，目前實驗已證實多種促進成骨的藥物同時具有抑制成脂的作用，如維生素D3

［5］、利賽膦酸［6］、姜黃素［7］等，本研究就川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞增殖和成脂分化影響進行探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 3T3-L1前脂肪細胞株由本研究所凍存，川續斷皂苷Ⅵ購于四川維克奇生物公司，DMEM高糖培養液、胰酶購自Hyclone公司，胎牛血清、地塞米松、IBMX、胰島素、油紅O染液購自GIBCO公司，噻唑藍購自科昊公司，葡萄糖及游離脂肪酸檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，RNAiso Reagent、cDNA合成試劑盒、RT-PCR試劑盒購自TOYOBO。

1.2 主要方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細胞培養 3T3-L1前脂肪細胞用DMEM高糖培養液培養，置于37℃、5%CO2的培養箱，每隔2 d換液1次，倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.2.2 3T3-L1前脂肪細胞的誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞生長至完全融合后2 d開始誘導分化。即將DMEM完全培養液棄掉，換上含5 mg·L－1胰島素、0.5 mmol·L－1IBMX、1 μmol·L－1地塞米松的DMEM完全培養液培養，2 d后再換用含5 mg·L－1胰島素的 DMEM完全培養液培養2 d。隨后用DMEM完全培養液繼續培養2 d。

1.2.3 川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響 將3T3-L1前脂肪細胞以3×103/孔的密度接種于96孔板，培養24h后換以含不同濃度(0、0.1、1、10、50、100 μmol·L－1)川續斷皂苷Ⅵ的培養液，每組設5個復孔，分別在24、48和72 h檢測其增殖活性。加入20 μl 5 g·L－1MTT 工作液，置于37℃培養箱繼續孵育，4 h后吸凈孔中液體，每孔加150 μl二甲基亞砜，震蕩10 min后在酶標儀上讀取490 nm處的吸光度值。

1.2.4 川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 將3T3-L1前脂肪細胞接種至48孔板，待細胞完全融合2 d后開始誘導，分化過程中加入不同濃度川續斷皂苷Ⅵ(0、10、25、50 μmol·L－1)，觀察其對3T3-L1前脂肪細胞成脂分化的影響。

1.2.5 油紅O染色 誘導分化6 d后細胞經4%多聚甲醛固定30 min后，用平衡鹽溶液(PBS)洗滌3次，加入油紅O染液孵育60 min，吸棄液體用PBS漂洗3次，倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況并攝像。加入異丙醇(每孔200 μl)，5 min后通過酶標儀測量A520nm處的吸光度值。

1.2.6 葡萄糖及游離脂肪酸含量測定 收集各組誘導分化第6天培養液，參照試劑盒操作手冊說明，檢測各組葡萄糖及游離脂肪酸含量。

1.2.7 Q-PCR檢測成脂分化基因的表達 收集各組成脂誘導分化第6天細胞，用TRIzol試劑提取總RNA，分光光度計測定總 RNA濃度，A260/A280均在1.8～2.0之間。應用隨機引物和反轉錄酶試劑盒反轉錄合成cDNA，使用SYBR PremixEx TaqTM Real-time PCR試劑盒配制20 μl PCR反應體系，采用實時熒光定量PCR法檢測成脂相關基因mRNA表達，熒光定量PCR引物見Tab 1。PCR擴增條件為:93℃ 3 min，然后 93℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共45個循環。以目的基因擴增量/內參照(GAPDH)基因擴增量表示所要檢測基因的表達量。重復檢測3次，每次做3個復孔，分別計算同一樣品3個復孔的Ct值，以同一樣品中GAPDH Ct作為內參照，分別計算各組2－ΔΔCt，用以±s表示PPARγ和C/EBP α mRNA相對表達量。

Tab 1 Primer sequences of the detected genes in Q-PCR analysis

2 結果

2.1 川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響 與空白組相比，川續斷皂苷Ⅵ處理后對3T3-L1前脂肪細胞有促進增殖效應(P＜0.05)，結果如Tab 2。作用24 h后，從川續斷皂苷Ⅵ濃度為1 μmol·L－1開始，OD值隨藥物濃度增加而升高。隨著處理時間延長到72 h，只有100 μmol·L－1川續斷皂苷Ⅵ組OD值高于空白組，其余組促增殖效應不明顯(P＞0.05)。

Tab 2 Effects of asperosaponinⅥon the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte(±s，n=5)

Tab 2 Effects of asperosaponinⅥon the proliferation of 3T3-L1 preadipocyte(±s，n=5)

*P＜0.05 vs control

ASA/μmol·L －124 h 48 h 72 h 0 0.336 ±0.01 0.614 ±0.02 0.824 ±0.03 0.1 0.345 ±0.02 0.574 ±0.09 0.815 ±0.06 1 0.372 ±0.03* 0.634 ±0.06* 0.827 ±0.04 10 0.391 ±0.01* 0.665 ±0.03* 0.829 ±0.08 50 0.377 ±0.01* 0.665 ±0.05* 0.849 ±0.05 100 0.363 ±0.03* 0.601 ±0.04 0.896 ±0.04*

2.2 川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞分化的影響 于誘導分化過程中加入不同濃度川續斷皂苷Ⅵ(0、10、25、50 μmol·L－1)處理 6 d，采用油紅 O染色，顯微鏡下觀察并攝像，如Fig 1所示，川續斷皂苷Ⅵ抑制成脂，隨著藥物濃度增加3T3-L1細胞中被染色的脂滴含量明顯下降。用異丙醇萃取油紅O后，不同濃度組OD值與對照組比較均明顯下降(P＜0.05)，見 Fig 2。

Fig 1 Oil red O staining after adipogenic induction of differentiation for 6 days

Fig 2 Effects of asperosaponinⅥon lipid accumulation after adipogenic induction of differentiation for 6 days

2.3 川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞糖脂代謝的影響 誘導分化后第6天每組上清液中的葡萄糖及游離脂肪酸的濃度，結果顯示加入25、50 μmol·L－1川續斷皂苷Ⅵ組培養上清中葡萄糖高于對照(P＜0.05)，10 μmol·L－1川續斷皂苷Ⅵ抑制葡萄糖效應作用不明顯(P＞0.05);而各組游離脂肪酸濃度則均低于對照組(P＜0.05)，且呈劑量依賴性，見Fig 3。

Fig 3 Effects of asperosaponinⅥon the concentration of glucose(up)and non-esterified fatty acid(down)in culture supernatant after adipogenic induction of differentiation for 6 days

2.4 川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞成脂相關基因mRNA表達的影響 3T3-L1前脂肪細胞成脂誘導分化過程中，加入 10、25、50 μmol·L－1濃度組的川續斷皂苷Ⅵ處理6 d后均能明顯抑制PPARγ和C/EBP α mRNA表達(P＜0.05)，如Fig 4。各組PPARγ mRNA抑制率分別為 68.8%、42.2%、34.7%;C/EBP α mRNA表達量與對照組相比亦下降，各組分別為80.0%、32.3%、6.3%。為了研究川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞成脂作用的時間點，本實驗在成脂的不同時間(d 0～6，d 1～2，d 3 ～4，d 5 ～6)加入川續斷皂苷Ⅵ(50 μmol·L－1)，發現川續斷皂苷Ⅵ在成脂不同時間點加入均有抑制作用，成脂分化d 3-4加入川續斷皂苷Ⅵ抑制效應最明顯(PPARγ和C/EBP α mRNA抑制率分別為19.6%、26.4%，P＜0.05)，見 Fig 5。

3 討論

Fig 4 Effects of asperosaponinⅥat different concentrations on the transcriptional level of PPAR γ and C/EBP α mRNA after adipogenic induction of differentiation for 6 days

Fig 5 Effects of ASA VI(50 μmol·L －1)at various intervals on the transcriptional level of PPAR γ and C/EBP α mRNA after adipogenic induction of differentiation for 6 days

機體脂肪細胞分化過程包括定向分化和終末分化兩個階段［8］。由MSC向前體脂肪細胞分化的過程屬于定向分化，終末分化則是指前脂肪細胞形成成熟脂肪細胞的過程。前體脂肪細胞雖然具有成脂分化能力，但如果沒有外源性的成脂刺激，不會自發的進入終末分化階段。研究顯示多種轉錄因子和細胞周期蛋白參與了調節成熟脂肪細胞形成［9］，其中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)、CCAAT 增強子結合蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteins，C/EBPs)是終末分化過程中不可或缺的轉錄因子［10］。PPARs是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的核內受體家族，包括 PPARα、PPARβ 和 PPARγ，其中 PPARγ 與脂肪細胞分化最為密切。PPARγ與配體結合后被激活，與視黃酸X受體形成PPARγ-RXR異二聚體，進一步同反應元件結合激活靶基因最終導致終末分化的脂肪細胞形成［11］。C/EBP家族與脂肪細胞分化相關的 3個成員為:C/EBPα、C/EBPβ和 C/EBPδ。細胞接受成脂刺激后 C/EBPβ和 C/EBPδ的表達增加，促進成脂分化。在成脂分化后期C/EBPβ和C/EBPδ降低。C/EBPα可結合和激活特異性基因的啟動子，促進脂肪細胞進入終末分化階段［12］。本研究探討了川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞的增殖、成熟分化的影響及其機制。結果不僅發現，在處理 24 ～72 h 期間，1 ～100 μmol·L－1濃度川續斷皂苷Ⅵ均顯示有促進3T3-L1前脂肪細胞增殖作用，其中10 μmol·L－1濃度組作用24 h后細胞增殖最明顯，隨著川續斷皂苷Ⅵ濃度增加，促增殖效應不明顯;在處理72 h時，只有100 μmol·L－1川續斷皂苷Ⅵ組細胞增殖明顯高于空白組，其余組促增殖效應不明顯。該結果說明川續斷皂苷Ⅵ對3T3-L1前脂肪細胞有一定的促其增殖作用。這也可能提示存在川續斷皂苷Ⅵ在培養基中不穩定或者被細胞代謝等因素。其具體機制有待進一步研究。同時更主要發現有，10、25、50 μmol·L－1濃度川續斷皂苷Ⅵ能劑量依賴性抑制3T3-L1前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化，降低脂肪細胞中脂滴聚集，減少成脂誘導培養液中葡萄糖的吸收利用，并減少培養液中游離脂肪酸的形成。Q-PCR檢測結果則顯示川續斷皂苷Ⅵ能下調成脂過程中關鍵轉錄因子PPARγ和C/EBPα基因表達，也呈劑量依賴性。進一步研究還發現當在成脂分化的不同時間點加入50 μmol·L－1川續斷皂苷Ⅵ均能下調 PPARγ 和 C/EBPαmRNA表達，說明川續斷皂苷Ⅵ能作用成脂終末分化的整個環節，抑制脂肪細胞形成。但川續斷皂苷Ⅵ是否也能抑制成脂定向分化以及怎樣調節PPARγ和C/EBPα表達的信號機制還有待研究。

機體MSC是成脂分化和成骨分化的共同前體細胞，具有雙向性，但是相互制約。骨髓中MSC是造血干細胞微環境重要組成部分，也具有成骨和成脂雙向分化特性，向成骨細胞分化則對造血具有促進作用［13］，而向脂肪細胞分化則對造血具有負性作用［14］。在傳統中醫中川續斷皂苷Ⅵ已經顯示具有治療骨質疏松的作用，即促進成骨作用，但在抑制成脂分化方面的研究較少。本研究結果則不僅可進一步了解其藥理作用，同時可為研究臨床上骨髓脂肪化提供新的思路。

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