rhEPO對高糖狀態下大鼠Müller細胞凋亡及對Bcl-2和Bax表達的影響

孟 巖，李 艷，葉尚尚，張 月

(青島大學醫學院附屬醫院眼科，山東青島 266001)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病非常嚴重的并發癥，屬致盲性眼病，對患者的生活質量有重大危害。以往認為高血糖引發的視網膜微循環障礙是DR的主要損傷因素，近年來研究發現，視網膜神經細胞及膠質細胞的凋亡是DR早期的重要表現。視網膜Müller細胞是一種特殊的神經膠質細胞，也是視網膜內最主要的神經膠質細胞，該細胞是從外界膜延伸到內界膜，貫穿于整個視網膜，能維持視網膜的正常代謝，調節神經成分和血管成分之間相互作用;在病理狀態下，其異常活化與許多視網膜變性、缺血性疾病有著密切關系［1－2］。隨著對膠質細胞研究的深入，人們發現在DR早期視網膜血管病變之前Müller細胞形態結構和生理功能就已經發生了變化［3］。重組人促紅細胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)是與天然EPO具有相同生物學活性的糖蛋白，近年來發現其可以通過血－腦屏障和血－視網膜屏障，參與中樞神經及視網膜神經細胞缺血缺氧損傷的保護，具有廣泛的抗凋亡作用。

由于視網膜Müller細胞在維持視網膜結構和

功能上的重要性，本實驗擬在前期研究的基礎上，通過建立體外高濃度葡萄糖狀態下大鼠視網膜Müller細胞模型，采用TUNEL法檢測視網膜細胞凋亡情況，酶聯免疫吸附法檢測凋亡相關基因Bcl-2和Bax蛋白的表達水平，并給予rhEPO干預，通過分析各組細胞結構、功能的改變，來探討rhEPO對視網膜Müller細胞的保護作用及可能的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生3～5 d的SD乳鼠5只(符合國家醫用動物使用標準，動物合格證號:SLXK魯20080002)，山東魯抗醫藥股份有限公司的實驗動物中心提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 SD乳鼠視網膜Müller細胞的培養及純化

用75%酒精浸泡出生3～5 d標準實驗用SD大鼠處死，轉移至超凈臺，摘取眼球，去除眼前節及玻璃體，分離視網膜組織。細胞培養方法同李樹寧等［4］報道。培養期間，通過倒置相差顯微鏡，每天觀察培養瓶內細胞的形態、數量、及生長情況。取第2代細胞，用抗Müller細胞特異性谷氨酰胺合成酶抗體，行免疫細胞化學染色SP法對培養細胞進行鑒定。隨機計數每10個高倍鏡視野(×200)下，胞膜完整的陽性染色細胞數及細胞總數，計算陽性染色Müller細胞所占百分數。每次計數3次，實驗重復3次。

1.2.2 高糖模型的建立和實驗分組 細胞傳3代時接種于24孔板并進行高糖模型分組，葡萄糖濃度取 25 mmol·L－1:Ⅰ組:空白對照組(Control)，空白對照組不給予干預;Ⅱ組:高糖培養組(HG，high glucose);Ⅲ組:高糖+5 kU·L－1rhEPO組(HG+5 kU·L－1rhEPO);Ⅳ組:高糖 +10 kU·L－1rhEPO組(HG+10 kU·L－1rhEPO);Ⅴ組:高糖 +20 kU·L－1rhEPO 組(HG+20 kU·L－1rhEPO);Ⅳ組:高糖+40 kU·L－1rhEPO 組(HG+40 kU·L－1rhEPO)。1.2.3 原位缺口末端標記法(TUNEL)檢測細胞凋亡 6組細胞同時終止培養。培養液沖洗后加50 μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育 60 min，0.01 mol·L－1的PBS洗滌3次后，使用激發波長范圍為450－500 nm，發射波長范圍為515-565 nm(綠色熒光)，在熒光顯微鏡下觀察并照相。TUNEL陽性細胞計數:每組3孔，每孔連續觀察10個視野(×200)計數陽性細胞，求平均數。

1.2.4 ELISA方法檢測各實驗組Bcl-2和Bax的表達 分組后的細胞繼續培養2 d后，加入預冷的細胞裂解液(50 mmol·L－1Tris-Cl，200 mmol·L－1NaCl，2 mmol·L－1EDTA，1%SDS，0.1 mmol·L－1PMSF)，低溫勻漿，離心收集上清液，設計標準孔、樣本孔及空白孔，采用雙抗體一步夾心法，酶標儀450 nm波長處，測定各孔A值。

1.3 統計學分析 實驗數據應用統計分析軟件SPSS 11.0，實驗結果以±s表示，多組資料均數間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 大鼠視網膜Müller細胞體外培養及鑒定 剛接種的細胞呈球形或卵圓形，懸浮于培養基內。24 h后細胞基本貼壁，伸出短小突起。48 h后細胞體積增大，突起變長，發出分支。3～6 d時，細胞增多并增大，細胞突起明顯。1～2周時，貼壁細胞達到80%融合。經反復胰蛋白酶消化，絕大多數細胞形態較一致，胞體狹長，胞質豐富，核呈圓形或卵圓形。GS免疫細胞化學法示陽性細胞胞核呈棕黃色，在光鏡下，每10個高倍鏡(×200)視野下，細胞總數平均為(566±3)個，陽性反應的細胞數平均為(539±5)個，陽性率為95.2%，表明2次傳代的細胞絕大部分已是純化的視網膜Müller細胞。

2.2 TUNEL法檢測Müller細胞凋亡 空白對照組僅見極少量陽性細胞表達(Fig 1A)，高糖組同空白組相比凋亡細胞明顯增多(P＜0.05)(Fig 1B)。而各rhEPO干預組TUNEL陽性細胞同高糖組相比明顯減少(P＜0.05)。見Fig 1C～F，Fig 2。

Fig 1 A few TUNEL positive cells in the retinal Müller cells

Fig 2 Apoptotic cells of different groups

2.3 Bcl-2及 Bax蛋白表達 空白對照組大鼠視網膜神經細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達都較少，高糖組Bcl-2蛋白的表達明顯降低，而Bax蛋白的表達明顯增強，與正常對照組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。rhEPO各劑量組Bcl-2蛋白的表達比高濃度葡萄糖培養組高，Bax蛋白的表達降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)(Tab 1，2)

Tab 1Expression of Bcl-2 in different groups(±s，n=4)

Tab 1Expression of Bcl-2 in different groups(±s，n=4)

△P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs HG

Group Bcl-2(average absorbance)q P Control 101.98 ±3.56 － －HG 56.08 ±5.12△ 17.99△ ＜0.01△HG+5 kU·L－1rhEPO 67.47 ±4.73# 4.47# ＜0.05#HG+10 kU·L－1rhEP 76.32 ±7.21# 7.94# ＜0.01#HG+20 kU·L－1rhEPO 85，43 ±3.11# 11.51# ＜0.01#HG+40 kU·L－1rhEPO 90.72 ±5.76# 13.58# ＜0.01#

Tab 2Expression of Bax in different groups(±s，n=4)

Tab 2Expression of Bax in different groups(±s，n=4)

△P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs HG

Group Bax(average absorbance)q P Control 3.98 ±0.35 － －HG 5.92 ±0.21△ 13.02△ ＜0.01△HG+5 kU·L－1rhEPO 5.31 ±0.15# 4.09# ＜0.05#HG+10 kU·L－1rhEP 5.06 ±0.32# 5.77# ＜0.05#HG+20 kU·L－1rhEPO 4.72 ±0.27# 8.05# ＜0.01#HG+40 kU·L－1rhEPO 4.34 ±0.41# 10.61# ＜0.01#

3 討論

關于細胞培養，先行多聚賴氨酸預處理細胞培養瓶使Müller細胞更好貼附于瓶上;視網膜Müller細胞較其他細胞貼壁緊，在細胞貼壁后，用吸管反復吹打瓶底，使未貼壁或貼壁不緊的組織塊和細胞懸浮，從而達到純化目的［5－7］。另外，待細胞長滿培養瓶后，加入少量0.25%胰蛋白酶反復多次消化后細胞形態基本一致。通過以上方法獲得高數量和質量的標本，在體外建立了穩定的Müller細胞培養體系。

國內報道在STZ-糖尿病大鼠模型中，糖尿病組與正常對照組相比，視網膜神經層細胞凋亡數量增多，同時Bcl-2蛋白表達降低而Bax蛋白表達增多，Bcl-2/Bax比值下降。而使用EPO干預后的糖尿病組，Bcl-2蛋白表達增多，同時Bax蛋白表達又明顯降低，Bcl-2/Bax比值升高［8－10］。有動物實驗顯示，外源性EPO對腦缺血、自身免疫性脊髓炎、脊髓束或外周神經損傷等多種神經系統疾病有保護作用［11－12］。視網膜是中樞神經系統的延續，EPO 同樣參與了缺血性視網膜神經組織的保護。體內外實驗均有證明，EPO可以促進血管生成，通過增加血供來促進神經功能恢復。另外，EPO還能減輕缺血過程中的炎癥反應而起到神經保護作用。更重要的是，有研究證明 EPO可以通過酪氨酸蛋白激酶(PTK-2)，激活級聯信號轉導途徑，防止神經組織的細胞凋亡。與天然分離的EPO相比，重組人促紅細胞生成素(rhEPO)具有相同氨基酸排列序列，且在體內、外生物學活性基本一致。這些研究表明，EPO可能通過控制抗凋亡Bcl-2和促凋亡基因Bax的平衡來發揮神經保護作用。

本文通過體外培養SD乳鼠視網膜Müller細胞，從細胞形態學、細胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白的表達方面，考察rhEPO對視網膜Müller細胞高濃度葡萄糖損傷的保護作用。研究結果表明，空白對照組大鼠視網膜神經細胞中Bcl-2、Bax表達都較少，高糖組同空白組相比凋亡細胞增多，且Bcl-2蛋白的表達降低、Bax蛋白的表達增強，與空白對照組比較差異均有顯著性(P＜0.05)。各 rhEPO干預組TUNEL陽性細胞同高糖組相比明顯減少，Bcl-2蛋白表達比高糖組高，Bax蛋白的表達降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。因此我們推測，rhEPO對糖尿病視網膜Müller細胞具有保護作用，可以抑制細胞凋亡，其機制可能與增強Bcl-2蛋白的表達，而降低Bax蛋白的表達有關，為rhEPO用于臨床治療糖尿病早期視網膜損傷提供了一定理論依據。

目前臨床醫師對DR的治療大多只注意其后期發生的增殖性改變，針對早期視網膜神經細胞及神經膠質細胞的凋亡尚無明確有效的治療藥物，隨著科研人員相關研究的進步，結合上述實驗結果，表明以rhEPO為代表的抗凋亡制劑未來將在臨床應用中發揮更加重要的作用。

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