人參皂苷Rg1的抗抑郁作用及對突觸超微結構的影響

黃 倩，楚世峰，張均田，陳乃宏

(1.天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，新藥作用機制研究與藥效評價北京市重點實驗室，中國醫(yī)學科學院藥物研究所，北京 100050;2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193)

抑郁癥(depression)是由各種原因引起的以抑郁為主要癥狀的一組心境障礙或情感性障礙，包括注意缺失、無快感體驗、睡眠障礙、反復自殺念頭等，是一種高發(fā)病、高致殘、高復發(fā)的疾病［1］。其病因和病理生理學機制復雜，至今尚未完全闡明。可能與社會、心理，以及遺傳、應激、神經內分泌異常、神經遞質功能紊亂等各種生物學因素有關［2］。目前突觸丟失以及突觸超微結構的改變也被認為是抑郁發(fā)病機制之一，越來越受到人們的關注［3］。人參(Panax ginsengCA Mey)是五加科植物的根莖，享有百草之王的美譽。人參皂苷Rgl是人參的標志性成分，前期研究已經證明，人參皂苷Rg1具有改善神經退行性疾病的作用，如老年癡呆、腦缺血、帕金森病。它還能夠增加神經發(fā)生和突觸可塑性，具有重要的神經保護作用［4］。而人參皂苷Rg1是否具有抗抑郁的作用并沒有得到廣泛的研究和認同，所以本研究是通過慢性應激模型來探討人參皂苷Rg1的抗抑郁活性以及對突觸超微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 ♂ SD 大鼠，250～300 g，60只，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。合格證編號:SCXK-2011V0012。大鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房中，平均室溫和相對濕度控制在(22±2)℃和(55±5)%。無應激期間，5只動物一籠。動物在動物房中適應5 d后開始進行實驗。

1.1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rg1(云南極粹生物科技有限公司提供，純度≥98%);鹽酸度洛西汀腸溶膠囊(禮來蘇州制藥有限公司，批號:A873537C)。戊二醛固定液、四氧化鋨固定液、Epon812樹脂包埋劑、醋酸雙氧鈾染液、檸檬酸鉛染液均由北京神經外科研究所超微病理研究室提供。

1.1.3 主要儀器 H-7650投射電子顯微鏡(Hitachi公司，北京神經外科研究所超微病理研究室)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 SD♂大鼠60只，隨機分為6組，每組10只。①正常組:正常飼養(yǎng);②模型組:接受28 d慢性溫和不可預見性應激制備抑郁模型。③陽性對照組:抑郁模型 +度洛西汀(10 mg·kg－1);④ 人參皂苷Rg1低劑量組:抑郁模型+人參皂苷Rg1(5 mg·kg－1);⑤人參皂苷Rg1中劑量組:抑郁模型+人參皂苷Rg1(10 mg·kg－1);⑥人參皂苷Rg1高劑量組:抑郁模型+人參皂苷Rg1(20 mg·kg－1)。人參皂苷Rg1易溶于水，雙蒸水溶解，分別配制成 0.5、1、2 g·L－1溶液;度洛西汀將其膠囊中內容物放入研缽研成粉末，加入雙蒸水，制成1 g·L－1混懸液)，單次單劑量灌胃給藥。正常組和模型組以相同方式按體重給予雙蒸水。

1.2.2 慢性溫和不可預見性應激大鼠模型 按照文獻方法［5］進行抑郁大鼠模型的制備。除正常組之外其余各組均接受慢性應激28 d，包括:禁食24 h，禁水 24 h，噪音 1 h，傾斜 45°12 h，冰水游泳 10℃6 min，通宵照明 12 h，夾尾 1 min，擁擠 12 h，束縛 4 h，水平振蕩 160 r·min－145 min，濕墊料 12 h。每天隨機選擇2種刺激，共28 d。

1.2.3 行為學測定 強迫游泳實驗:給藥1 h后，將大鼠置于直徑50 cm，水深30 cm，水溫(25±2)℃的圓桶中，觀察5 min，記錄各組動物在整個5 min內的不動時間。不動狀態(tài)為:大鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態(tài)，僅有細小的肢體運動以保持頭部浮在水面的狀態(tài)。

糖水消耗實驗:快感缺失是抑郁癥的核心癥狀，對動物模型的評價則以一定時間內消耗一定濃度的蔗糖溶液量或百分比為衡量標準。首先給予大鼠質量分數(shù)為1%的蔗糖溶液預適應48、24 h后大鼠禁食禁水12 h，之后每只大鼠單籠飼養(yǎng)給予兩只相同的水瓶，分別裝有質量分數(shù)為1%的蔗糖水和正常飲用水，統(tǒng)計1h內大鼠攝入的蔗糖溶液和飲用水量，計算出蔗糖消耗百分比〔蔗糖消耗百分比=蔗糖溶液攝入量/(蔗糖溶液攝入量+飲用水攝入量)〕。

1.2.4 電鏡生物樣品制備 各組大鼠行為測試之后以水合氯醛腹腔麻醉，灌流固定，開顱取腦，在解剖鏡下切取額前皮質區(qū)組織塊，并將該組織切成1 mm3的小塊，經四氧化鋨固定2 h后，梯度酒精脫水，Epon812包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，每例觀察3張銅網，先在低倍率(×5 000)下觀察，最終放大到10萬倍拍照，每只大鼠至少拍攝4對清晰的突觸結構。

2 結果

2.1 人參皂苷Rg1對抑郁大鼠絕望行為的影響強迫游泳實驗中，動物在水中的不動時間說明了抑郁動物的一種絕望行為。模型組大鼠的不動時間與正常組相比有明顯增加(P＜0.01)。人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg－1組與模型組相比，不動時間明顯減少(P＜0.01)，見 Tab 1。

2.2 人參皂苷Rg1對抑郁大鼠興趣缺失行為的影響 興趣缺失是抑郁癥的核心癥狀之一，而糖水消耗實驗可以反映大鼠的快感缺失狀態(tài)。Tab 2的結果顯示，與正常組相比，模型組大鼠糖水攝入百分比明顯降低(P＜0.01)，而給予人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg－1組均可明顯增加應激大鼠的糖水攝入百分比(P＜0.01)。

Tab 1 Effects of Ginsenoside Rg1 on immobility time in forced swim test in rats(n=10)

Tab 2 Effects of Ginsenoside Rg1 on sucrose intake percentage in sucrose preference test in rats(n=10)

2.3 慢性應激對大鼠前額皮層突觸超微結構的影響及人參皂苷Rg1的改善作用 我們主要觀察的是前額皮層突觸前膜附近的突觸囊泡密度和突觸后致密物質厚度。如Fig 1所示，圖中突觸均為GrayⅠ型突觸，即后膜致密物比前膜厚，兩膜之間有明顯的突觸間隙，稱為不對稱突觸，也是興奮性突觸。

Fig 1 Ginsenoside Rg1 improves synaptic ultrastructure in prefrontal cortex of CUMS rats(n=3)

對照組，突觸前膜附近聚集著許多突觸囊泡，以清亮圓形無核心小泡為主，比較密集;突觸后膜有濃密的電子致密物質，較厚。模型組與對照組相比，突觸前膜附近的突觸囊泡密度明顯減小，變得稀疏;突觸后致密物質厚度也明顯減小。給予人參皂苷Rg1低、中、高劑量和陽性藥度洛西汀，均能改善突觸的異常變化。尤其Rg1 10、20 mg·kg－1組與模型組相比，突觸前膜附近的突觸囊泡密度明顯變大，突觸后致密物質厚度也明顯增大，與正常組很接近。

3 討論

慢性溫和不可預知性應激(CUMS)可模擬一系列抑郁癥的核心癥狀，如興趣缺失、絕望行為、睡眠障礙等等，是一個典型的、常用的研究抑郁模型，用于抗抑郁新藥的篩選、臨床作用機制及抑郁癥病理生理機制的研究。本研究采用CUMS建立大鼠抑郁模型，選擇強迫游泳和糖水偏好這兩個經典的行為學實驗，來檢測抑郁大鼠的絕望行為和興趣缺失等行為障礙。我們的研究結果證明了人參皂苷Rg1 5、10、20 mg·kg－1劑量均能減少抑郁大鼠在強迫游泳實驗中的不動時間，增加糖水的攝入量，對CUMS誘導的抑郁行為和突觸超微結構的異常有很好的改善作用。但人參皂苷Rg1高、中、低劑量組之間并沒有表現(xiàn)出量效關系，在行為學實驗中均呈陽性結果，且組間差異無顯著性。可能原因是在神經精神領域的研究中，往往存在最適劑量，并不是在一定劑量范圍內，隨劑量增加作用效力也增加，因為神經通路、神經遞質及受體間的影響因素太多。

大量研究證明，應激可以導致腦內結構的改變，這種改變集中體現(xiàn)在神經元結構可塑上，如突觸、樹突、樹突棘及細胞的數(shù)量。抑郁大鼠的腦中多個腦區(qū)都存在突觸和突觸棘丟失的現(xiàn)象，樹突長度也有縮短，如海馬、額前皮質、前扣帶皮層等［6－7］。額前皮質區(qū)，是一個與情緒調節(jié)有著密切的聯(lián)系腦區(qū)。額葉受損的人，嚴重影響著他的情緒和社會行為，大多數(shù)人容易患有精神分裂癥、重性抑郁和焦慮［8］。因此本研究選擇了額前皮質區(qū)作為主要的腦內區(qū)域，來研究抑郁癥造成的突觸結構的變化。有文獻報道［9］，應激可導致額前葉皮層突觸數(shù)量減少，而且額前葉皮層容積也有所縮小。我們的實驗結果證明，長期應激會使大鼠額前皮質區(qū)突觸超微結構發(fā)生改變，突觸前膜的突觸囊泡密度明顯減小，突觸后致密物質厚度也明顯減小。在口服給予人參皂苷Rg1后，突觸囊泡密度和突觸后致密物厚度都有明顯增大，抑郁的行為也有所改善。

我們實驗室的前期研究還證明，人參皂苷Rg1能改善認知功能和性功能障礙，調節(jié)內分泌，提高突觸可塑性和神經發(fā)生，還具有雌激素樣的保護作用［10－13］。這些研究都說明人參皂苷Rg1除了能改善抑郁的核心癥狀外，還能治療抑郁的一些伴隨癥狀，如認知障礙、性功能障礙等等。而且從微觀的角度去探究抑郁癥機制，人參皂苷Rg1還能夠改善突觸的超微結構。因此人參皂苷Rg1很有可能成為臨床新型、安全的抗抑郁劑。

［1］劉佳莉，苑玉和，陳乃宏.抑郁癥的治療研究進展［J］.中國藥理學通報，2011，27(9):1193 －6.

［1］Liu J L，Yuan Y H，Chen N H.Research progress in treatment of depression［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(9):1193 － 6.

［2］李云峰，張有志.抗抑郁及抗狂躁藥［M］.張均田，張慶柱，張永祥，主編.神經藥理學.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:522－50.

［2］Li Y F，Zhang Y Z.Antidepressant drug and antimanic drug［M］.Zhang J T，Zhang Q Z，Zhang Y X.Chief editor.Neuropharmacology.Beijing:People’s Medical Publishing House，2008:522－50.

［3］Morinobu S.Physiopathological mechanism of depression in relation to neurotrophic and growth factors and synaptic plasticity［J］.Seishin Shinkeigaku Zasshi，2009，111(6):687 －91.

［4］李 娜.人參皂苷Rg1治療神經退行性疾病的研究進展［J］.中國老年學雜志，2012，32(15):3345 －7.

［4］Li N.Research progress in gensenoside Rg1 treatment of neurodegenerative disease［J］.Chin J Gerontol，2012，32(15):3345 －7.

［5］Sun J D，Liu Y，Yuan Y H，et al.Gap junction dysfunction in the prefrontal cortex induces depressive-like behaviors in rats［J］.Neuropsychopharmacolog，2012，37:1305－20.

［6］Bennett M R.The prefrontal-limbic network in depression:A core pathology of synapse regression ［J］.Prog Neurobiol，2011，93(4):457－67.

［7］Sorra K E，Harris K M.Overview on the structure，composition，function，development，and plasticity of hippocampal dendritic spines［J］.Hippocampus，2000，10:501 －11.

［8］王一牛，羅躍嘉.前額葉皮質損傷患者的情緒異常［J］.心理科學進展，2004，12(2):161－7.

［8］Wang Y N，Luo Y J.Emotional disorders in patients with prefrontal cortex lesions［J］.Adv Psychol Sci，2004，12(2):161 －7.

［9］Marsden W N.Synaptic plasticity in depression:Molecular，cellular and functional correlates［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2013，43(2):168－84.

［10］張均田.人參皂苷Rgl的促智作用機制——對神經可塑性和神經發(fā)生的影響［J］.藥學學報，2005，40(5):385－8.

［10］Zhang J T.Nootropic mechanisms of ginsenoside Rgl—influence on neuronal plasticity and neurogenesis［J］.Acta Pharm Sin，2005，40(5):385－8.

［11］Shen L，Zhang J.NMDA receptor and iNOS are involved in the effects of ginsenoside Rg1 on hippocampal neurogenesis in ischemic gerbils［J］.Neurol Res，2007，29(3):270 －3.

［12］Shen L H，Zhang J T.Ginsenoside Rg1 promotes proliferation of hippocampal progenitor cells［J］.Neurol Res，2004，26(4):422－8.

［13］李文娜，肖 苑，黃燮南.人參皂苷Rg1非心血管和神經系統(tǒng)藥理活性研究進展［J］.中國藥理學通報，2012，28(6):751－4.

［13］Li W N，Xiao Y，Huang X N.Research progress on pharmacological effects of Ginsenoside Rg1 on non-cardiovascular and non-central nervous systems［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(6):751－4.