CaMKⅡ信號通路在黃芪多糖抑制異丙腎上腺素誘導心肌細胞肥大中的作用

張 靜，王洪新，楊 娟，魯美麗，李勝陶，喻曉春

(1.遼寧醫學院 遼寧省心腦血管藥物重點實驗室，遼寧，錦州 121001;2.中國中醫科學院實驗中心，北京 100700)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心臟對體內外各種刺激產生的一種適應性反應，隨著疾病的進展，最終可導致心力衰竭［1］。β腎上腺素能受體是調節心臟功能的主要受體，其在心臟中的信號轉導機制一直是研究的熱點，β受體興奮后導致炎癥因子的活化，并且涉及多種心血管疾病［2］。研究發現異丙腎上腺素(Iso)誘導心肌肥厚的過程中涉及炎癥反應，使機體炎癥因子如白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等含量增加［3］。有證據表明黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)具有一定的抗炎作用，可明顯減少脂多糖誘導的人單核細胞株THP21中IL-6的表達及分泌［4］。本實驗室已證明:① Iso可激活CaMKⅡ 信號通路誘導心肌細胞肥大［5］，② APS對Iso誘導心肌細胞肥大具有一定的保護作用［6］，其APS的劑量是本實驗 APS的參考依據。然而APS是否通過抑制CaMKⅡ信號通路保護心肌及CaMKⅡ在Iso誘導心肌細胞肥大所致炎癥反應中的作用，目前尚無報道。本實驗運用 10 μmol·L－1的Iso為誘導劑［7］，進一步探討APS對Iso誘導心肌細胞肥大的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和試劑 出生1～3天的SD乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(遼)2003－0007。黃芪多糖為陜西森弗生物技術有限公司，批號:HQ090312，純度98%;Iso、PRO、二甲基亞砜(DMSO)﹑十二烷基硫酸鈉(SDS)﹑CaMKⅡ抑制劑KN93均購自美國sigma公司;低糖DMEM培養基購自Gibco公司;小牛血清購自美國Hyclone公司;RT-PCR試劑盒、引物、Marker均購自大連寶生物工程有限公司;CaMKⅡδ一抗購自Santa Cruz;IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒購自 R＆D公司;其他試劑均為分析純。

1.2 體外乳鼠心肌細胞原代培養 體積分數為0.75的乙醇消毒，無菌開胸，迅速取出心臟，置于盛有D-Hanks溶液培養皿中清洗，修剪心臟僅留心尖部分并剪成大小約為0.5～1.0 mm3的碎塊，加入0.8 g·L－1胰蛋白酶溶液，37℃分次恒溫消化，第一次10 min，棄上清，以后均為8 min，消化4～5次。將消化好的細胞置于體積分數為0.15小牛血清、0.84低糖DMEM和0.01雙抗(含濃度均為100 U·L－1的青霉素和鏈霉素)吹打均勻后，裝入25 cm2培養瓶(或24孔培養板)中，37℃，5%CO2孵箱中培養。采用差速貼壁法純化心肌細胞，然后將細胞調至所需密度(培養瓶為5×106，培養板為5×105)置于孵箱中繼續培養。

1.3 分組及給藥方法 常規培養心肌細胞48 h后，為減少血清成分對實驗結果的影響，更換體積分數為0.0004小牛血清的低糖培養基繼續培養24 h，待細胞生長周期同步化后進行實驗。實驗所需藥品Iso、APS和PRO均為水溶性，三蒸水溶解后0.22 μm針式濾器除菌;KN93溶于DMSO，為消除DMSO對心肌細胞的毒性作用，其在培養基中的體積分數需小于0.001。給藥組APS、KN93和PRO預先孵育30 min，加入Iso，48 h后進行各指標的測定。實驗共分為 8 組:①正常對照組;②Iso(10 μmol·L－1);③KN93(0.2 μmol·L－1);④Iso+KN93;⑤Iso+APS(0.1 mg·L－1);⑥Iso+APS(1 mg·L－1);⑦Iso+APS(10 mg·L－1);⑧Iso+PRO(2 μmol·L－1)。

1.4 心肌細胞體積的測定 取“1.3”處理的各組細胞，PBS快速沖洗長滿細胞的培養孔，每孔加入質量分數為0.1% 的胰蛋白酶，放入37℃ 恒溫箱中孵育10 min左右，隨后每孔加入含體積分數為0.1×102血清的培養基終止消化。將同組細胞合并收集注入一細胞室內(該細胞室底部是一經硅化的蓋玻片，防止心肌細胞貼壁)，在放大400倍的倒置顯微鏡下觀察細胞，幾乎呈球形。用計算機CIAS大恒細胞圖像分析系統測量單個細胞的直徑，進而計算出細胞的體積。每孔隨機選擇4個視野，每個視野測20個細胞。

1.5 心肌細胞總蛋白質含量的測定 取“1.3”處理的各組細胞，吸去各孔中的培養液，PBS溶液沖洗3次，加入SDS使細胞裂解，為減少去垢劑對實驗結果的影響，SDS的含量應低于0.01%。根據計數，每孔細胞數約為5×105個，采用 Bradford法測定細胞的總蛋白含量。

1.6 ELISA法檢測心肌細胞外液IL-6和TNF-α的含量 取“1.3”處理的各組細胞上清液，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELISA試劑盒說明進行操作，完畢后在全自動酶標儀于450 nm波長讀取吸光度值，繪制標準曲線，根據各標本吸光度值在標準曲線上得出相應的濃度。

1.7 RT-PCR法檢測心肌細胞 ANP mRNA的表達 收集“1.3”處理的各組細胞，加入 TRIzol試劑800 μl裂解細胞，收集細胞裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，用DEPC處理水回收總RNA。以質量濃度為10 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計A260/A280鑒定RNA濃度和純度，純度以大于1.8為宜。取約1 μg總 RNA進行反轉錄。反轉錄條件為:30℃ 10 min;45℃ 30 min;95℃ 5 min。ANP 引物:up:5'-GGGCTCCTTCTCCATCAC-3'，down:5'-CCCTCAGTTTGCTTTTCA-3'(348 bp);內參GAPDH的引物序列為:up:5'-AATGCATCCTGCCACCACCAACTGC-3'，down:5'-CCAGGCCATGTAGTAGGCCATGAGGTC-3'(550 bp)。PCR反應條件:94℃45 s，55℃ 50 s，72 ℃ 1 min 15 s。循環擴增結束后，取10 μl產物進行質量濃度為20 g·L－1的瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后，置于凝膠成像系統進行觀察和分析。

1.8 Western blot法測心肌細胞 CaMKⅡδ蛋白水平 收集“1.3”處理的各組細胞，BCA法蛋白定量。保證上樣量相同條件下計算出每組應吸取樣品上清的體積，用上樣緩沖液補至 80 μl，再加 100 μl溴酚藍染液煮沸4 min，然后各取10 μl樣品以及蛋白質標準品點樣，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。初始電壓為90 V，觀察 Marker的移動情況，適時終止電泳。轉膜、封閉、洗膜，然后取所需部分與稀釋過的一抗(1∶1 000)4℃雜交過夜，第2日用 TBST洗膜3次，然后室溫與二抗作用至少1 h，再次洗膜3次，加ECL顯色，上機檢測。

1.9 統計學處理 采用 SPSS 16.0軟件進行統計學分析，數據均以±s表示，采用單因素方差分析和LSD法。

2 結果

2.1 APS對心肌細胞形態學改變的影響 Fig 1顯示，在倒置相差顯微鏡下觀察，正常對照組心肌細胞呈梭形、三角形和不規則形，有突起，呈放射狀排列;Iso組細胞較為飽滿且明顯肥大，可見少量細胞碎片;KN93組(CaMKⅡ抑制劑 )細胞形態與正常對照組無明顯差異;Iso+KN93組和Iso+不同濃度黃芪多糖組均對肥大的心肌細胞有一定的改善作用，表現為細胞體積變小，細胞碎片減少，且黃芪多糖從低劑量(0.1 mg·L－1)、中劑量(1 mg·L－1)到高劑量組(10 mg·L－1)，保護作用依次增強，呈劑量依賴性。

2.2 APS對心肌細胞體積及蛋白含量的影響Tab 1顯示，與正常對照組相比，Iso組心肌細胞體積增大了88.3%，總蛋白含量增加了55.3%;KN93組細胞體積和總蛋白含量未見明顯改變，提示CaMKⅡ的抑制劑對正常心肌細胞無影響;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組心肌細胞體積分別減小了45.2%、44.7%、27.6%、35.2%、45.2%，細胞總蛋白含量分別降低了 33.9%、33.4%、13.5%、25.0%、34.7%;提示KN93組、PRO組和APS低、中、高劑量組均可對Iso誘導的心肌細胞肥大產生一定的抑制作用，且APS存在劑量依賴性。

Fig 1 Pictures of the cultured neonatal rat cardiomyocytes(×400)

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

Tab 1 Effects of different treatments on cell size and total protein content of cultured myocardial cells induced by Iso［±s，n=80(size)，n=6(protein)］

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group Cell size/μm3 Protein/μg(in 5 ×105cells Normal 1170 ±112 17.15 ±1.1 Iso 10 μmol·L －1 2204 ±167＊＊ 26.63 ±1.6＊＊KN93 0.2 μmol·L －1 1181 ±141 17.28 ±1.1 Iso+KN93 1208 ±139## 17.59 ±1.3##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1597 ±189## 23.03 ±1.7##Iso+APS 1 mg·L －1 1428 ±144##□ 19.98 ±2.7##□Iso+APS 10 mg·L －1 1203 ±116##△ 17.39 ±1.5##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1218 ±156## 17.72 ±1.5##)

2.3 APS對心肌細胞外液中IL-6和TNF-α表達的影響 Tab 2顯示，與正常對照組相比，Iso組心肌細胞外液中IL-6的含量增加了65.9%，且TNF-α含量的增加大于100%;KN93組細胞外液中IL-6和TNF-α的含量未見明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組中IL-6和TNF-α的含量均明顯較少，且APS存在劑量依賴性;提示 APS可以減少炎癥因子 IL-6和TNF-α的釋放，保護心肌。

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

Tab 2 Effects of different treatments on expression of IL-6 and TNF-α in cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group IL-6/ng·L－1 TNF-α/ng·L －1 Normal 131.2 ±1.9 22.8 ±2.9 Iso 10 μmol·L－1 217.7 ±6.8＊＊ 68.4 ±4.7＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 138.4 ±2.8 25.3 ±2.3 Iso+KN93 141.7 ±1.8## 27.2 ±1.6##Iso+APS 0.1 mg·L －1 185.2 ±4.2## 36.4 ±3.3##Iso+APS 1 mg·L －1 163.7 ±4.7##□ 29.4 ±3.9##□Iso+APS 10 mg·L－1 140.0 ±2.4##△ 26.8 ±2.3##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 143.9 ±3.2## 28.4 ±3.4##

2.4 APS對心肌細胞ANP mRNA表達的影響Tab 3和Fig 2顯示，與正常對照組相比，Iso組心肌細胞ANP mRNA的表達明顯增高了46.9%;KN93組ANP mRNA的表達未見明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組ANP mRNA的表達均降低，差異有統計學意義;表明KN93組、PRO組、黃芪多糖組均對Iso誘導的心肌細胞肥大有一定的抑制作用，提示阻斷CaMKⅡ信號通路可能對心肌有保護的作用。

2.5 APS對心肌細胞CaMKⅡδ蛋白表達的影響

Tab 4和Fig 3顯示，與正常對照組相比，Iso組CaMKⅡδ蛋白表達明顯增高了;KN93組蛋白表達未見明顯改變;與Iso組相比，Iso+KN93組、Iso+PRO組和黃芪多糖低、中、高劑量組CaMKⅡδ蛋白表達均明顯降低，差異有統計學意義;提示黃芪多糖可能通過抑制CaMKⅡ信號通路的激活，從而達到保護心肌的作用。

Fig 2 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 3 Effects of different treatments on ANP mRNA expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group ANP mRNA(IA ANP/IA GAPDH)Normal 1.021 ±0.028 Iso 10 μmol·L－1 1.922 ±0.085＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 1.029 ±0.017 Iso+KN93 1.141 ±0.038##Iso+APS 0.1 mg·L －1 1.406 ±0.159##Iso+APS 1 mg·L －1 1.211 ±0.097##□Iso+APS 10 mg·L－1 1.047 ±0.153##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 1.351 ±0.172##

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

Tab 4 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured myocardial cells induced by Iso(±s，n=4)

＊＊P＜0.01 vs normal group;##P＜0.01 vs Iso;□P＜0.05 vs APS 0.1 mg·L－1;△P ＜0.05 vs APS 1 mg·L－1

Group A CaMKⅡδ/A β-actin Normal 0.61 ±0.02 Iso 10 μmol·L－1 0.94 ±0.05＊＊KN93 0.2 μmol·L－1 0.63 ±0.01 Iso+KN93 0.65 ±0.02##Iso+APS 0.1 mg·L －1 0.81 ±0.06##Iso+APS 1 mg·L －1 0.72 ±0.08##□Iso+APS 10 mg·L－1 0.64 ±0.06##△Iso+PRO 2 μmol·L －1 0.67 ±0.05##

Fig 3 Effects of different treatments on CaMKⅡδ expression of cultured neonatal rat cardiomyocytes

3 討論

心肌肥厚是心臟對各種病理性刺激產生的一種適應性生理反應。最初，可能是心臟為適應正常的室壁應力和保持收縮功能，但這種適應過程可能逐步發展為擴張型心肌病、心肌纖維化、心律失常、心力衰竭甚至猝死［8］。研究發現［9］，心肌肥厚過程中，肥厚基因的表達增高，且有炎癥因子的過度表達。Serra等［10］研究發現，Iso誘導的心肌肥厚中TNF-α和IL-6的表達水平增高，運動療法使促炎性因子明顯減少，改善心肌收縮力，抑制左心室肥厚，防止心室重塑，保護心肌。因此，炎癥在心肌肥厚中的作用是不能忽視的。

CaMKⅡ是一種普遍存在的、多效性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在心臟中以 δ亞型為主［11］。CaMKⅡ通過與鈣化的鈣調蛋白(Ca2+/CaM)結合，使其抑制性結構域移位，發生自動磷酸化而被激活［12］。研究發現［13］，持續的心肌損傷通過激活CaMKⅡ信號通路，使促炎基因表達，產生炎癥反應，進而發生心肌肥厚，因此，CaMKⅡ可以作為連接心肌肥厚和炎癥信號通路的樞紐。實驗表明，抑制CaMKⅡ的活性可以減少心肌肥厚、防止功能性重構及心律失常的發生［14］。Singh 等［15］發現，在野生型大鼠后壁心肌梗死模型中，CaMKⅡ被氧化激活，肥厚的標志性基因的表達上調，促炎基因如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、補體因子 B(Cfb)的含量明顯增多，并且發生心肌細胞壞死和心肌纖維化。

本實驗發現，經Iso處理的心肌細胞體積增大、總蛋白含量增多及ANP mRNA的表達增高，表明肥大模型成功;APS和CaMKⅡ阻斷劑KN93均可明顯減少上述表現，除此之外，均可使CaMKⅡδ蛋白的表達降低，且APS的劑量越大，效果越明顯，呈現一定的劑量依賴性，提示阻斷CaMKⅡ可降低ANP mRNA的表達，抑制心肌肥厚;同時APS可通過阻斷CaMKⅡ有效抑制Iso誘導的心肌細胞肥大。實驗還發現，經Iso處理的心肌細胞外液中IL-6和TNF-α的含量增加，APS和CaMKⅡ阻斷劑KN93均可減少炎癥因子IL-6和TNF-α的釋放，APS在此亦呈劑量依賴性，提示APS通過阻斷CaMKⅡ抑制炎癥因子的產生。故APS可以通過阻斷CaMKⅡ信號通路減少炎癥因子的產生，抑制炎癥反應和心肌細胞肥大，從而保護心肌。

眾多研究表明，心肌肥厚的過程中涉及CaMKⅡ的激活和炎癥反應，但APS是否可以通過減少炎癥反應阻斷CaMKⅡ達到保護心肌的作用，目前尚不清楚，本實驗通過研究黃芪多糖對CaMKⅡ信號通路的影響，進一步深入研究心肌肥厚的可能機制和中國傳統中藥黃芪的保護作用，為心肌肥厚等心血管疾病的防治提供新思路。黃芪多糖抑制心肌肥厚的過程中，是否涉及其它通路及是否與CaMKⅡ信號通路存在交互作用有待于進一步的研究。

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