脂多糖通過LDLr誘導巨噬細胞泡沫化:炎癥應激下巨噬細胞泡沫化的另一條通路

葉 強，雷 寒，鄭文武，鄭舒展，陳壓西

(1.瀘州醫學院附屬醫院心血管內科，四川瀘州 646000;2.重慶醫科大學脂質研究中心重慶市糖脂代謝重點實驗室，3.重慶醫科大學附屬第一院心血管內科，重慶 400016)

動脈粥樣硬化的特點是血管內膜下脂質，特別是膽固醇和膽固醇酯的沉積，巨噬細胞、T細胞等炎癥細胞浸潤，以及中膜平滑肌細胞遷移增殖。巨噬細胞清道夫受體在攝取化學修飾的脂蛋白如氧化和乙酰化低密度脂蛋白(LDL)中具有重要作用，并導致巨噬細胞轉化為泡沫細胞［1－3］。除此之外，巨噬細胞可以通過非受體介導的胞吞作用攝取大顆粒的脂蛋白，從而造成胞內脂質聚集［4］。

LDL受體(LDLr)是結合血漿來源LDL膽固醇和調節血漿膽固醇水平的主要受體，LDLr活性受依賴于細胞內膽固醇濃度的負反饋系統的嚴密調控［5］。該系統通過調控LDLr介導的LDL攝入以及新生膽固醇合成，確保肝細胞和其他細胞胞內膽固醇水平穩定。因而，傳統觀念認為LDLr不會參與細胞內膽固醇聚集以及泡沫細胞形成。

最近實驗及臨床研究發現，炎癥應激是脂質介導細胞損害導致動脈粥樣硬化和腎小球硬化的促進因素，我們前期研究發現，在人腎小球系膜細胞和肝細胞，炎癥因子通過固醇調控元件結合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)-固醇調控元件結合蛋白2(SREBP2)兩個重要蛋白，干擾LDLr負反饋調控，導致泡沫細胞形成和非酒精性脂肪肝及胰島素抵抗［6－15］。

細菌脂多糖(LPS)是一種常用炎癥刺激物，通過作用于Toll樣受體4(TLR-4)通路，激活轉錄因子-核因子κB(NF-κB)，進而增加細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1β(IL-1β)合成分泌，導致炎癥應激狀態，故常用于細胞實驗［16］。

巨噬細胞是泡沫細胞的重要來源，在動脈粥樣硬化發生發展中有重要作用，然而，炎癥應激狀態下巨噬細胞的LDLr負反饋調控情況尚不清楚，本研究探討LPS誘導的炎癥應激是否通過干擾SCAPSREBP2介導的LDLr負反饋調控導致巨噬細胞泡沫化。

1 材料

人單核細胞系(THP-1)，購于美國典藏生物中心(ATCC)，No:TIB-202;細胞生長培養基 RPMI 1640、胎牛血清(FCS)購于北京Hyclone公司;佛波酯(PMA)、小牛血清白蛋白(BSA)、青霉素、鏈霉素、LPS(Escherichia coli)、四乙酸乙二胺(EDTA)、叔丁基對甲酚(BHT)、聚肌苷酸 polyinosinic acid(Poly(I))、肝素鈉heparin和二甲基亞砜(DMSO)均購于Sigma;LDL:采用兩步法密度梯度超速離心方法，從人新鮮液體血漿中自行制備;細胞內膽固醇測定試劑購于Sigma;總RNA提取試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購于大連TaKaRa;逆轉錄試劑盒購于美國ABI;細胞蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物技術公司;Bradford試劑購自北京百泰克生物技術有限公司;30%Acrylamide/Bis購于上海生工;Protein marker購于 Fermentas(立陶宛);Anti-LDLr一抗購于武漢博士德(BA1230)，host:rabbit，120ku;Anti-SREBP2一抗購于 LGC Promochem，UK，host:mouse，120ku;Anti-SCAP一抗倫敦大學學院皇家自由醫學院阮雄中教授提供，host:rabbit，125kDa;Antiactin 一抗購于 Santa Cruz(SC-1616-R)，host:rabbit，42ku;Goat anti-rabbit HRP-linked IgG購于Santa Cruz(SC-2004);Goat anti-mouse HRP-linked IgG購于MultiSciences Biotech(國內分裝);硝酸纖微膜購于Amersham Biosciences;TNF-α ELISA試劑盒購于R＆D公司(晶美生物分裝，FHK0019);Synergy HT 96孔板酶標閱讀儀購于Bio-Tek;瓊脂糖購于Sigma;蘇丹黑B購于上海生工;mouse anti-human Golgi一抗購于Molecular Probes(Cat:A21270);goat antirabbit Fluor(Green)488 for SCAP二抗購于Molecular Probes(Cat:A11034);goat anti-mouse Fluor(Red)594 for Golgi二抗購于 Molecular Probes(Cat:A11032);激光共聚焦顯微鏡(Leica confocol microscope，Germany)。

2 方法

2.1 細胞培養及分組 THP-1生長至對數期，加入PMA誘導分化為巨噬細胞，無血清培養基培養4 h，進入實驗分組，實驗培養基為含抗氧化劑EDTA及BHT的無血清培養基，對照組:實驗培養基繼續培養;高脂組:實驗培養基中加入LDL，終濃度為25 mg·L－1;高脂加炎癥刺激組:實驗培養基中加入LDL，終濃度為 25 mg·L－1，再加入 LPS，終濃度為200 μg·L－1;高脂加炎癥刺激加 Poly(I)組，實驗培養基中加入 LDL，終濃度為 25 mg·L－1，再加入LPS，終濃度為 200 μg·L－1，再加入 Poly(I)，終濃度為250 mg·L－1;高脂加炎癥刺激加heparin組，實驗培養基中加入LDL，終濃度為25 mg·L－1，再加入 LPS，終濃度為 200 μg·L－1，再加入 heparin 終濃度為5 g·L－1;單純炎癥刺激組:實驗培養基中加入 LPS，終濃度為 200 μg·L－1，以上各組細胞培養24 h后收獲。

2.2 ELISA法檢測細胞培養基中 TNF-α 水平培養于24孔板上的THP-1巨噬細胞，無血清培養4 h后，實驗培養基中加入不同濃度LPS(0、10、100、500、1 000 μg·L－1)孵育 24 h，收集培養基，－70℃保存;收集細胞，Lowry法測定細胞蛋白含量;按照R＆D公司TNF-α試劑盒操作說明進行檢測，所得數據用細胞總蛋白含量進行校正。

2.3 細胞內膽固醇濃度測定 測定THP-1巨噬細胞內膽固醇濃度的酶染色法基于Gallo［17］和 Gamble［18］所描述的方法，實驗分組為:對照組，高脂組，高脂加炎癥刺激組，高脂加炎癥刺激加Poly(I)組，高脂加炎癥刺激加heparin組，單純炎癥刺激組，以上進入實驗細胞孵育24 h后，用PBS洗滌2次，氯仿/甲醇2∶1混合物提取細胞內脂質，后真空干燥，Lowry法測定細胞總蛋白含量，酶法測定總膽固醇濃度(TC)，游離膽固醇濃度(FC)，經公式膽固醇酯(CE)=TC-FC，計算出膽固醇酯水平，最后所有結果用細胞蛋白含量校正。

2.4 LDL瓊脂糖電泳 THP-1巨噬細胞培養于24孔板，無血清培養4 h后，加入25 mg·L－1LDL，繼續孵育24 h，收集培養基，蘇丹黑 ∶培養基=1∶9混合后，室溫下孵育20 min，上1%瓊脂糖橋聯電泳，電泳參數為:巴比妥電泳緩沖液，pH值8.6，離子強度0.075，電壓 200 V，電流 400 mA，時間 20 min，天然LDL和氧化LDL分別作為陽性與陰性對照。

2.5 總RNA提取及Real-time PCR 根據RNAiso試劑盒操作說明提取實驗THP-1巨噬細胞總RNA，500 ng總RNA作為模板，選用ABI逆轉錄試劑盒，逆轉錄體系 20 μl，含:50 mmol·L－1KCl，10 mmol·L－1Tris.HCl，5 mmol·L－1MgCl2，每種 dNTP 濃度為 1 mmol·L－1，2.5 μmol·L－1random hexamers，20 U RNAsin，和 50 U Moloney-murine leukemia virus RTase;逆轉錄在DNA Thermal Cycler(Eppen-dorf)中進行，參數為:25℃ 10 min，37℃ 120 min，85℃ 5 s;cDNA合成后，用SYBR Green I PCR Master Mix(Takara)在Opticon 2 Real-Time PCR Detector(Bio-Rad)進行熒光定量PCR反應，熱循環條件包括 50℃ 2 min，95℃ 5 min，95℃ 20 s，55℃ 20 s，共40 個循環，95℃ 1 min，55℃ 1 min，55℃到95℃每增加0.5℃讀板，作溶解曲線。實驗在細胞水平重復4次。β-actin作為參照基因。Real-time PCR結果以CT值來表示起始模板的數量，CT值越小起始模板的數量越大。本實驗均用比較CT值法－△△CT來表示基因的表達水平，計算公式如下:實驗組相對于對照組基因表達水平的倍數=－exp(△△CT)，其中△△CT=實驗組△CT－對照組△CT△CT=靶基因CT值－β-actin CT值。引物序列:LDL receptor上游 5'-GTGTCACAGCGGCGAATG-3'，下游 5'-CGCACTCTTTGATGGGTTCA-3';SREBP2上游5'-CCG CCTGTTCCGATGTACAC-3'，下游 5'-TGCACATTCA GCCAGGTTCA-3';SCAP上游 5'-GGGAACTTCTGG CAGAATGACT-3'，下游5'-CTGGTGGATGGTCCCAA TG-3';β-actin上游 5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，下游 5'-GCCGATCCACACACGGAGTACT-3';所有引物由ABI公司Primer Express Software version 2.0 System設計。

2.6 Western blot檢測蛋白表達 收集并裂解巨噬細胞，定量總蛋白和胞核蛋白濃度，變性，電泳，轉硝酸纖維膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，PBST洗滌2次，硝酸纖維膜與兔抗人LDLr多克隆抗體稀釋液在室溫下孵育1 h，PBST洗滌液洗滌3次，羊抗兔HRP標記二抗稀釋液與硝酸纖維膜在室溫下孵育1 h，PBST洗滌3次，最后應用 ECL Advance Western blot Detection化學發光試劑盒在Hyperfilm ECL自顯影成像;硝酸纖維膜50℃下抗體剝脫液洗滌20 min，PBST洗滌3次后，分別加入鼠抗人SREBP2單克隆抗體及羊抗鼠二抗，以及兔抗人SCAP多克隆抗體和羊抗兔二抗。

2.7 激光共聚焦掃描檢測SCAP定位 培養于24孔板上THP-1巨噬細胞經實驗處理后，PBS洗滌2次，5%福爾馬林生理鹽水室溫下固定30 min;再用0.25%TritonX-100處理細胞15 min。1%BSA室溫下封閉20 min。加入Rabbit anti-human SCAP一抗(終濃度1∶100)和mouse anti-human Golgi antibody(終濃度 1 ∶100)，200 μl/孔，4℃ 過夜。PBST 洗滌3次，加入 goat anti-rabbit Fluor488 for SCAP二抗(終濃度1∶100)和goat anti-mouse Fluor594 for Golgi二抗(終濃度 1 ∶100)，200 μl/孔，室溫下孵育 1 h。PBST洗滌3次，50%PBS甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖片。

3 結果

3.1 生理條件(非炎癥)下，LDL負荷對巨噬細胞LDLr mRNA表達的影響 生理條件(非炎癥狀態)下，當細胞加載LDL時，不同濃度LDL均可以顯著抑制巨噬細胞的LDLr mRNA的表達，其抑制程度與LDL濃度呈劑量相關性。本實驗確定25 mg·L－1LDL作為后續實驗的LDL負荷濃度，見Tab 1。

Tab 1 Effect of LDL loading on LDLr mRNA level inmacrophages under physiological condition(±s)

Tab 1 Effect of LDL loading on LDLr mRNA level inmacrophages under physiological condition(±s)

#P＜0.05 vs control group，*P＜0.05 vs 25 mg·L－1LDL group.

LDL/mg·L－10 25 50 100 200 LDLr mRNA level 1 0.25±0.09# 0.13 ±0.12# 0.11±0.05# 0.02 ±0.008*

3.2 LDL負荷條件下，不同濃度LPS對巨噬細胞LDLr mRNA表達的影響 25 mg·L－1LDL明顯抑制巨噬細胞LDLr mRNA表達，同時有LPS存在時，LDL抑制LDLr mRNA表達的反饋調節被減弱，并且LPS呈劑量依賴性上調巨噬細胞LDLr mRNA表達。本實驗確定200 μg·L－1LPS作為后續實驗的有效炎癥刺激濃度，見Tab 2。

Tab 2 Effect of LPS on LDLr mRNA level in macrophages under LDL loading(±s)

Tab 2 Effect of LPS on LDLr mRNA level in macrophages under LDL loading(±s)

#P＜0.05 vs control group，＊＊P＜0.05 vs 25 mg·L－1LDL group.

LDL/mg·L－10 25 25 25 25 25 LPS/μg·L －1 0 0 50 100 200 400 LDLr mRNA level 1 0.37±0.09#0.39±0.22 0.50±0.11 0.70±0.35* 0.72 ±0.31*

3.3 LPS呈濃度依賴性增加巨噬細胞合成分泌TNF-α LPS可以明顯增加巨噬細胞向培養基中分泌炎癥因子TNF-α，且這種效應呈劑量依賴性，200 μg·L－1LPS可成功誘導炎癥狀態，作為后續實驗有效炎癥刺激濃度，見Tab 3。

Tab 3 Effect of LPS on the secretion of TNF-α in macrophages( ± s)

Tab 3 Effect of LPS on the secretion of TNF-α in macrophages( ± s)

*P＜0.05 vs 10 μg·L －1group.

LPS/μg·L －1010 100 500 1000 TNF-α concentration/ng·L－1 1028.83±68.351042.33±165 1890±565.69*2304±613.58*3482±1032.56*

3.4 細胞內膽固醇測定結果 細胞內膽固醇測定結果顯示，當細胞培養基中僅有25 mg·L－1LDL存在時，細胞內膽固醇酯水平輕度增加，當同時有200 μg·L－1LPS存在時，細胞內膽固醇酯水平明顯增加。應用清道夫受體阻斷劑聚肌苷酸Poly(I)和LDLr阻斷劑heparin后，數據表明清道夫受體阻斷劑Poly(I)未減少細胞內膽固醇酯沉積，而LDLr阻斷劑heparin卻可以減少膽固醇酯聚集，單獨LPS刺激也能增加細胞內膽固醇酯水平，見Tab 4。

Tab 4Cholesterol ester detection(±s)

Tab 4Cholesterol ester detection(±s)

*P＜0.05 vs 25 mg·L－1LDL group，#P＜0.05 vs 25 mg·L－1LDL+200 μg·L－1 LPS group，△P＜0.05 vs control group.

Group TC FC CE Control 14.31 ±1.79 9.52 ±1.95 4.79 ±1.21 LDL 25 mg·L －1 16.41±2.67 10.82±2.51 5.59±2.03 LDL25 mg·L －1+LPS 200 μg·L －1 21.90±2.01* 13.10±1.20* 8.80±1.80*LDL25 mg·L－1+LPS 200 μg·L－1+Poly(I)250 mg·L－1 21.72±2.11* 13.51±1.60* 8.22±1.30*LDL25 mg·L－1+LPS 200 μg·L－1+Heparin 5 g·L －1 13.92±1.10# 9.60±1.05# 4.32±1.31#LPS 200 μg·L －1 18.10±1.31△ 11.20±1.68△ 6.9±0.54△

3.5 LDL瓊脂糖電泳結果 LDL瓊脂糖電泳證實，來自巨噬細胞培養基中的LDL與天然LDL有相同電泳遷移率，與氧化LDL遷移率明顯不同，提示巨噬細胞培養基中LDL沒有被氧化修飾，見Fig 1。

Fig 1 LDL agarose gel electrophoresis

3.6 LPS對巨噬細胞LDLr mRNA及蛋白表達的影響 Real-Time PCR發現，LPS增加LDLr mRNA表達水平，克服25 mg·L－1LDL對LDLr mRNA表達的反饋抑制;Western blot也證實25 mg·L－1LDL抑制LDLr蛋白表達，LPS克服25 mg·L－1LDL對LDLr反饋抑制，增加LDLr蛋白表達;單獨LPS刺激也增加LDLr mRNA及蛋白表達，見Fig 2。

3.7LPS對巨噬細胞SREBP2和SCAP mRNA及蛋白表達的影響 Real-Time PCR發現，LPS增加SREBP2和SCAP mRNA表達水平，克服25 mg·L－1LDL對SREBP2和SCAP mRNA表達的抑制效應;Western blot也證實25 mg·L－1LDL抑制 SREBP2和SCAP蛋白表達，LPS克服25 mg·L－1LDL對SREBP2和SCAP蛋白表達抑制，增加SREBP2和SCAP蛋白表達;單獨LPS刺激也增加SREBP2和SCAP mRNA及蛋白表達，見Fig 3，Fig 4。

Fig 2 Effect of LPS on LDLr mRNA and protein expression in macrophages

Fig 3 Effect of LPS on SREBP2 mRNA and protein expression in macrophages

Fig 4 Effect of LPS on SCAP mRNA and protein expression in macrophages

3.8 激光共聚焦結果 抗人SCAP與抗高爾基體的共染色發現，25 mg·L－1LDL抑制SCAP從內質網轉位至高爾基體，然而LPS克服25 mg·L－1LDL對SCAP轉位的抑制，增加SCAP從內質網轉位至高爾基體，導致SCAP在高爾基體堆積，單獨LPS刺激同樣增加SCAP從內質網至高爾基體轉位，見Fig 5。

Fig 5 Effect of LPS on the translocation of SCAP-SREBP2 complex from the ER to the Golgi in the presence of LDL

4 討論

傳統觀念認為，清道夫受體是巨噬細胞泡沫化的主要途徑，氧化修飾LDL被認為是動脈粥樣斑塊中泡沫細胞內膽固醇的主要來源，并且天然LDL與巨噬細胞共孵育后，LDL不會通過LDLr大量進入細胞內致膽固醇積聚。然而，最近研究發現，佛波酯激活的單核巨噬細胞會通過非受體介導的內吞作用增加對LDL攝取，導致巨噬細胞內膽固醇聚集，提示液相內吞作用是巨噬細胞調控膽固醇聚集的一條有意義的途徑［19］。

LDLr是結合血漿來源LDL膽固醇和調節血漿膽固醇水平的主要受體，然而，巨噬細胞內膽固醇聚集過程中LDLr所起的作用仍不是很清楚。本研究發現，LPS通過LDLr途徑增加天然LDL在巨噬細胞內聚集，如Tab 2所示。清道夫受體特異性抑制劑聚肌苷酸Poly(I)不能抑制LPS誘導的巨噬細胞內膽固醇聚集，而LDLr受體抑制劑肝素heparin卻能抑制LPS誘導的膽固醇酯聚集，說明LDLr參與了LPS誘導的膽固醇聚集。這一結果與以前我們在平滑肌細胞上發現的現象一致。除此以外，所有實驗培養基都含有目前廣泛使用的抗氧化劑BHT和EDTA，這兩種抗氧化劑可以有力的防止LDL氧化;并且培養基中的LDL電泳遷移率與天然LDL一致，說明實驗中沒有LDL被氧化，因為培養基中沒有清道夫受體的配體存在，證實LDLr介導了巨噬細胞內膽固醇堆積，有效排除了清道夫受體途徑參與脂質聚集。進一步實驗發現LPS上調LDLr mRNA和蛋白表達，擾亂了LDLr負反饋調控。這些結果提示，炎癥應激可以通過擾亂LDLr負反饋調控改變細胞內膽固醇穩態。

我們研究LPS逆轉25 mg·L－1LDL對LDLr反饋抑制效應的分子機制，特別是炎癥應激狀態下調控LDLr表達的兩個重要分子SCAP和SREBP2的表達和細胞內轉位。最近，胰島素誘導基因1(Insig1)被確定為固醇調控的內質網滯留因子，在內質網上與SCAP-SREBP2復合物相互作用。當細胞內膽固醇濃度升高時，Insig1結合SCAP的固醇敏感區域，防止SCAP-SREBP2逃離內質網，減少LDLr轉錄合成，減少外源性膽固醇攝入，防止細胞內膽固醇增多;當細胞內膽固醇濃度降低時，Insig1與SCAP-SREBP2復合物分離，SCAP攜帶SREBP2轉位至高爾基體，SREBP2經過高爾基體上蛋白水解后，活性片段SREBP2-N進入細胞核內，與固醇調控元件1(SRE-1)結合，啟動LDLr轉錄合成，促進細胞攝取外源性膽固醇。我們的結果表明SCAP的mRNA和蛋白表達對膽固醇的反應是相似的，提示SCAP是膽固醇敏感器。實驗結果表明，炎癥應激增加SCAP和SREBP2 mRNA和蛋白表達，進而增加SCAP/Insig1比率，這似乎是假設，因為Insig1在內質網上的數量有限，在炎癥狀態下沒有足夠量固定表達增加的SCAP-SREBP2復合物;因而炎癥應激狀態下，即使在細胞內高膽固醇濃度水平下，SCAPSREBP2復合物從內質網逃逸至高爾基體，這種非正常逃逸擾亂了LDLr生理反饋調控。

總之，這些結果提示LPS擾亂了THP-1巨噬細胞內LDLr依賴膽固醇的正常而又嚴密的反饋調控，因而在LPS存在下，天然LDL通過LDLr被巨噬細胞大量攝入，導致膽固醇酯堆積，這一過程將THP-1巨噬細胞轉變為泡沫細胞。本研究提示，在炎癥應激下，天然LDL無需氧化修飾既可被巨噬細胞大量攝取，LDLr可能是巨噬細胞泡沫化的另一條重要通路。

［1］Nicholson A C，Febbraio M，Han J，et al.CD36 in atherosclerosis.The role of a class B macrophage scavenger receptor［J］.Ann N Y Acad Sci，2000，902:128－31.

［2］Krieger M.Molecular flypaper and atherosclerosis:structure of the macrophage scavenger receptor［J］.Trends Biochem Sci，1992，17:141－6.

［3］Krieger M，Abrams J M，Lux A，Steller H.Molecular flypaper，atherosclerosis，and host defense:structure and function of the macrophage scavenger receptor［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1992，57:605－9.

［4］Liu B，Xie C，Richardson J A，et al.Receptor-mediated and bulk-phase endocytosis cause macrophage and cholesterol accumulation in Niemann-Pick C disease ［J］.J Lipid Res，2007，48:1710－23.

［5］Smith J R，Osborne T F，Goldstein J L，Brown M S.Identification of nucleotides responsible for enhancer activity of sterol regulatory element in low density lipoprotein receptor gene［J］.J Biol Chem，1990，265:2306－10.

［6］Ruan X Z，Varghese Z，Powis S H，et al.Disregulation of LDL receptor under the influence of inflammatory cytokines:a new pathway for foam cell formation［J］.Kidney Int，2001，60:1716－25.

［7］Ruan X Z，Moorhead J F，Tao J L，et al.Mechanisms of disregulation of low-density lipoprotein receptor expression in vascular smooth muscle cells by inflammatory cytokines［J］.Arteriosclerosis Thrombosis Vascul Biol，2006，26(5):1150－5.

［8］Ruan X Z，Moorhead J F，Fernando R，et al.PPAR agonists protect mesangial cells from interleukin 1 belta-induced intracellular lipid accumulation by activating the ABCA1 cholesterol efflux pathway［J］.J Am Soc Nephrol，2003，14:593－600.

［9］Ruan X Z，Varghese Z，Fernando R，Moorhead J F.Cytokine regulation of low-density lipoprotein receptor gene transcription in human mesangial cells［J］.Nephrol Dial Transplant，1998，13:1391－7.

［10］Chen Y，Ruan X Z，Li Q，et al.Inflammatory cytokines disrupt LDL-receptor feedback regulation and cause statin resistance:a comparative study in human hepatic cells and mesangial cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，293:F680－7.

［11］Chen Y Y，Chen Y，Zhao L，et al.Inflammatory stress exacerbates hepatic cholesterol accumulation via increasing cholesterol uptake and de novo synthesis［J］.J Gastroen Hepatol，2012，27(5):974－84.

［12］Ruan X Z，Varghese Z，Moorhead J F.An update on the lipid nephrotoxicity hypothesis［J］.Nat Rev Nephrol，2009，5:713－21.

［13］Xu Z E，Chen Y，Huang A，et al.Inflammatory stress exacerbates lipid-mediated renal injury in ApoE/CD36/SRA triple knockout mice［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2011，301(4):F713－22.

［14］Zhao L，Chen Y，Tang R，et al.Inflammatory stress exacerbates hepatic cholesterol accumulation via increasing cholesterol uptake and de novo synthesis［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26(5):875－83.

［15］Li L C，Varghese Z，Moorhead J F，et al.Cross-talk between TLR4-MyD88-NF-kappaB and SCAP-SREBP2 pathways mediates macrophage foam cell formation［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2013，304(6):H874－84.

［16］石翠格，胡 剛，汪 海.NF-κB在動脈粥樣硬化中的始動作用［J］.中國藥理學通報，2004，20(4):382－5.

［16］Shi C G，Hu G，Wang H.Initialization effect of NF-κB on atherosclerosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2004，20(4):382－5.

［17］Gallo L L，Atasoy R，Vahouny G V，Treadwell C R.Enzymatic assay for cholesterol ester hydrolase activity ［J］.J Lipid Res，1978，19:913－6.

［18］Gamble W，Vaughan M，Kruth H S，Avigan J.Procedure for determination of free and total cholesterol in micro-or nanogram amounts suitable for studies with cultured cells［J］.J Lipid Res，1978，19:1068－70.

［19］Kruth H S，Huang W，Ishii I，Zhang W Y.Macrophage foam cell formation with native low density lipoprotein［J］.J Biol Chem，2002，277:34573－80.