腎寧合劑微生物限度檢查方法的驗證

曾云勝 張先洲

1.湖北省仙桃市第一人民醫院藥劑科，湖北仙桃 433000；2.武漢大學人民醫院藥學部，湖北武漢 430060

腎寧合劑是本院結合臨床研制的醫院制劑，由黃芪、益母草、敗醬草、川芎等組成，具有益氣活血、利水消腫、調節免疫功能的功效，用于急慢性腎炎、腎病綜合征、糖尿病性腎病、急慢性腎功能衰竭等疾病。據調查目前微生物限度不合格是醫院制劑不合格的主要因素之一[1]，為控制產品質量，本研究按照2010年版《中華人民共和國藥典》（簡稱“中國藥典”）附錄的相關規定[2]，參考相關文獻對腎寧合劑微生物限度檢查方法進行了驗證[3-4]，以保證患者用藥的安全有效，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 供試品

腎寧合劑，規格：100 ml，由本院制劑室生產；批號:20120413。1.2培養基

營養瓊脂培養基，批號：110116；營養肉湯培養基，批號：110112；玫瑰紅鈉瓊脂培養基，批號：110112；4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養基（MUG），批號：100820；pH 7.0改良馬丁瓊脂培養基，批號：101106；無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號：100824。以上培養基均由北京三藥科技開發公司提供。

1.3 驗證試驗用菌種

金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，枯草芽胞桿菌 （Bacillus subtilis）[CMCC （B）63501]， 黑曲霉（Aspergil1us niger）[CMCC（F）98003]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]。 以上菌種均由中國藥品生物制品檢定研究院提供。

1.4 儀器和設備

SHINVA立式壓力蒸汽滅菌器 （山東新華醫療器械股份有限公司），超凈工作臺（蚌埠凈化設備廠），LRH-250生化培養箱 （上海一恒科學儀器有限公司），HTY-2000A集菌儀，HTY反復使用集菌培養器 （杭州高得醫療器械有限公司）等。

2 細菌、真菌及酵母菌計數方法的驗證

2.1 菌液制備

接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基上，經25℃培養18～24 h，取1 ml加入到9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-5，為50～100 CFU/ml菌懸液備用。

接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌與枯草芽胞桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基上，經35℃培養18～24 h，取1 ml加入到9 ml 0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-6～10-7（50～100 CFU/ml）的菌懸液備用。

接種黑曲霉菌的新鮮培養物于改良馬丁瓊脂斜面培養基上，25℃培養5 d，加入0.05% 聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液5 ml，將孢子洗脫，吸出孢子懸液至無菌試管內，用0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液10倍遞增稀釋制成每毫升含孢子數50～100 CFU的孢子懸液，備用。

將上述5種菌液分別接種至相應的培養基上，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌，35℃培養2 d；黑曲霉、白色念珠菌，25℃培養 2～3 d。

2.2 供試液制備

取供試品10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成1︰10的供試液。

2.3 細菌、真菌及酵母菌計數方法的驗證

供試品對照組：取1∶10的供試液1 ml，立即傾注瓊脂培養基，凝固后，置規定溫度下，細菌培養 24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培養48～72 h，按菌落計數方法測定供試品本底菌數。試驗組：取1∶10的供試液1 ml和50～100 CFU/ml試驗菌，分別注入平皿中，傾注營養瓊脂培養基及玫瑰紅鈉瓊脂培養基，5種試驗菌株每株試驗菌分別制備2個平皿，按平皿法測定其菌數。菌液組：取各試驗菌50～100 CFU注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，平行制備2個平皿，凝固后，置規定溫度下，細菌培養24～48 h，白色念珠菌和黑曲霉菌培養48～72 h，測定所加入的實驗菌數。

試驗組回收率計算：回收率=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液組的平均菌落數×100%。

驗證結果提示，5株試驗菌人工染菌回收率達到70%以上，表明采用常規法做驗證試驗，方法可行（表1）。

表1 腎寧合劑微生物限度檢查方法的驗證結果（常規法）（CUF/ml）

3 控制菌檢查方法的驗證（常規法）

試驗組：取1∶10的供試液10 ml和小于100 CFU/ml大腸埃希菌試驗菌液加到100 ml膽鹽乳糖増菌培養基中，35℃培養24～48 h。取培養物0.2 ml，接種至含MUG培養基5 ml的試管中，35℃培養24 h，在366 nm紫外燈下觀察熒光，同時用未接種的MUG培養基作本底對照。試驗管MUG為陽性，靛基質試驗為陽性，本底對照管為陰性。

陰性菌對照組：同試驗組，取小于100 CFU的金黃色葡萄球菌加入到100 ml膽鹽乳糖増菌培養基中。陰性菌對照組MUG為陰性，靛基質試驗為陰性，本底對照管為陰性。

上述驗證結果提示試驗組檢出了大腸埃希菌，而陰性菌對照組未檢出金黃色葡萄球菌，說明可采用常規法對本品進行控制菌（大腸埃希菌）檢查。

根據以上驗證結果，腎寧合劑的微生物限度檢查按照中國藥典2010年版第一部附錄微生物限度檢查法 （附錄ⅧC）檢查，細菌、真菌及酵母菌數測定和控制菌檢查均可采用常規法檢驗。具體方法如下：

供試液制備：取本品供試液10 ml，加pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100 ml，制成1∶10的供試液。

細菌數測定：取 1∶10、1∶100、1∶1000 的供試液，采用平皿法測定，符合規定。

真菌及酵母菌數測定： 取 1∶10、1∶100、1∶1000 的供試液，采用平皿法測定，符合規定。

大腸埃希菌的檢查：取1∶10的供試液10 ml，加入到膽鹽乳糖增菌培養基100 mL中，依法檢查，符合規定。

4 討論

腎寧合劑是由多種中藥材經水煎煮醇沉提取后制成的澄明液體，含有多糖、淀粉、蛋白質類物質，這些物質為微生物繁殖提供了營養條件。如果微生物度檢查呈假陰性，當樣品存放后使用，會產生大量微生物甚至致病菌，因此對腎寧合劑進行微生物限度檢查具有重要意義[5]。

本試驗中菌液經稀釋至適宜濃度后，若在室溫下放置，應在2 h內使用，若保存在2～8℃可在24 h內使用，以確保細菌活性及菌數穩定[6-7]。本試驗經過考查證明，以1∶10腎寧合劑樣品作為最低稀釋級供試液，能夠消除藥品在微生物限度檢查中的抑菌作用，5種試驗菌的回收率均大于70%，表明稀釋劑 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無抑菌作用[8]，對實驗無干擾，符合中國藥典要求。

[1]安富榮，張純.2004~2007年上海市醫院制劑中抽檢不合格制劑質量問題分析[J].中國藥房，2008，19（28）：2211-2212.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄79-83.

[3]馬緒榮，蘇德模.藥品微生物學檢驗技術[M].北京：華齡出版社，2007：209.

[4]蘭鴻，李元宏，楊務彬.乳核內消液微生物限度檢查方法學驗證[J].醫藥導報，2011，30（6）：804-805.

[5]馬亮英，蔣磊.小兒腹瀉散微生物限度檢查方法驗證[J].中國現代藥物應用，2011，20 （5）：123-124.

[6]卜生高，王勁爭.喉咽清口服液微生物限度檢查方法的驗證[J].中國藥事，2009，23（12），1210-12112.

[7]袁汀.清熱合劑的微生物限度檢查方法的驗證[J].山西醫藥雜志，2011，40（9）：869-870.

[8]黃文嫻，金國良，王元培.5種醫院制劑微生物限度及其質量考察[J].抗感染藥學，2011，8（3）：198-199.