HIV-GAG質粒DNA疫苗的純化工藝

劉新濤,吳叢梅,臧 陽,孫 博,殷玉和

(1.長春工業大學 化學與生命科學學院,長春 130012;2.吉林大學 生命科學學院,長春 130012)

DNA疫苗是指直接向宿主體內免疫能編碼病原體有效抗原的質粒,相應抗原在體內進行表達后便誘導機體產生特異性抗體,并引起細胞免疫反應而獲得保護力[1-4].與傳統疫苗相比,DNA疫苗能夠誘導廣泛的免疫反應[5-6].由于質粒DNA的轉染效率較低,臨床應用中需要毫克級的質粒DNA,因此DNA疫苗必須達到克級以上的生產規模以滿足需要.本文建立了HIV-GAG藥用級質粒DNA疫苗規模化生產工藝,通過使用高鹽沉淀RNA、 中空纖維超濾濃縮、 離子交換介質和復合模式凝膠過濾介質,對質粒DNA純化,去除RNA、 染色體DNA、 宿主蛋白質和內毒素等雜質,獲得了高純度的質粒DNA.其工藝流程如圖1所示.

圖1 藥用級HIV-GAG質粒DNA疫苗工藝流程
Fig.1 Process flow sheet describing purification of HIV-GAG DNA

1 材料和方法

1.1 材 料

含有HIV核心抗原質粒的大腸桿菌菌株DH5α由吉林大學生命科學學院艾滋病疫苗國家工程實驗室提供.質粒大小為6.4 kb.CaptoTMcore 700和CaptoTMDEAE購于美國GE(GE Healthcare Life Science)公司.

1.2 細菌培養及堿裂解

E.coliDH5α菌種和LB培養基經搖瓶擴增培養后,轉接到生物反應器中于37 ℃培養,通過攪拌速度和補料速度控制溶氧量,收獲的細菌經離心后于-20 ℃保存.

取200 g大腸桿菌DH5α發酵菌體,加入1.6 L預冷溶液Ⅰ(50 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L EDTA,pH=8.0)中,攪拌混勻后,加入1.6 L溶液Ⅱ(0.2 mol/L NaOH,質量分數為1.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS)),緩慢攪拌10 min； 再加入1.6 L預冷溶液Ⅲ(3 mol/L KAc,pH=5.5),形成白色絮狀沉淀物,反應30 min,最后加入2.0 mol/L的CaCl2溶液1.6 L,搖勻,靜置1 h,溶液分為兩層,其中上層為白色絮狀物,下層為裂解液,將下層裂解液用蠕動泵導出并用1.0 μm孔徑的濾芯過濾除雜.

1.3 超濾濃縮

將裂解液通過Quickstand超濾分離系統用分子量為300 000的中空纖維超濾膜(美國GE Healthcare Life Science公司,膜面積850 cm2,膜纖維管直徑1 mm)過濾.經6.895 kPa膜負壓(TMP)1.5 h后,濃縮體積為200 mL,用注射用水將其稀釋5倍.

1.4 離子交換層析(CaptoTM DEAE)及凝膠過濾層析(CaptoTM core 700)

1.5 超濾濃縮及無菌過濾

將CaptoTMcore 700純化后樣品通過Quickstand超濾分離系統用分子量為300 000的中空纖維超濾膜(美國GE Healthcare Life Science公司,膜面積140 cm2,膜纖維管直徑1 mm)過濾.經6.895 kPa膜負壓1 h.

1.6 蛋白質量比的測定

用MicroBCA試劑盒(美國Pierce公司)測定HIV-GAG DNA疫苗中的蛋白質量比.反應體系中的混合物(100 μL HIV-GAG DNA疫苗樣品,100 μL micro-BCA試劑)在60 ℃水浴鍋中孵育30 min,在λ=562 nm下檢測蛋白的吸收值.

1.7 檢測基因組DNA和內毒素

用Southern blot方法[7]檢測基因組DNA污染.通過PCR方法擴增大腸桿菌DH 5α菌株16S RNA的361 bp片段(正向引物：5′-ACACGGTCCAGACTCCTACG-3′;反向引物：5′-TACACCTGGAATTCTACCCC-3′),用Digoxigenin-11-dUTP(美國Boehringer Mannheim公司)標記； 用堿性磷酸酶標記的地高辛對雜交探針進行免疫檢測,通過堿性磷酸酶底物顯色(NBT/BCIP)進行觀察.用鱟試劑(湛江安度斯生物有限公司)凝膠法檢測內毒素.

2 結果與討論

2.1 堿裂解及質粒粗純

細菌按1∶8分別加入溶液Ⅰ～Ⅲ和2.0 mol/L CaCl2進行菌體裂解,裂解液經過濾除雜后,通過Quickstand超濾系統用分子量為300 000的中空纖維超濾膜進行超濾濃縮.

2.2 CaptoTM DEAE色譜純化

裂解濃縮液經注射用水稀釋至電導值為合理數值的濃度.圖2為CaptoTMDEAE純化質粒DNA疫苗的色譜,其中峰1～ 峰3分別為緩沖液B洗脫RNA、 緩沖液C洗脫質粒DNA及CIP洗脫基因組DNA.各洗脫樣品的瓊脂糖凝膠電泳譜如圖3所示.由圖3可見,當加入高鹽氯化鈣時,去除了大部分RNA雜質； 裂解濃縮液經CaptoTMDEAE純化后,質粒濃度明顯提高,但仍存在少量RNA.

圖2 CaptoTM DEAE純化HIV-GAG DNA疫苗色譜Fig.2 CaptoTM DEAE purification of HIV-GAG DNA vaccine

1: 堿裂解未加CaCl2樣品;2: 堿裂解加CaCl2后樣品;3: 流穿峰樣品;4: 溶液B洗脫峰樣品;5: 溶液C洗脫峰樣品;6: CIP溶液洗脫峰樣品;7: 水洗脫峰樣品;8: 1 kb DNA Ladder.圖3 CaptoTM DEAE純化HIV-GAG DNA 疫苗瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoresisanalysis of CaptoTM DEAE purification of HIV-GAG DNA vaccine

2.3 CaptoTM core 700介質純化

用CaptoTMcore 700進一步純化質粒DNA,其色譜如圖4所示,其中峰1為質粒DNA峰,峰2為CIP溶液洗脫下來的雜質峰.圖5為經CaptoTMcore 700進一步純化獲得高純度質粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖譜.經超濾濃縮和無菌過濾,質粒DNA質量濃度達1.0 mg/mL.

圖4 CaptoTM core 700純化圖譜Fig.4 CaptoTM core 700 purification of HIV-DNA vaccine

1: CaptoTM core 700純化樣品;2: 1 kb DNA Ladder.圖5 CaptoTM core 700純化HIV-GAG DNA 疫苗瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.5 Agarose gel electrophoresisanalysis of CaptoTM core 700 purification of HIV-GAG DNA vaccine

2.4 HIV-DNA疫苗檢測結果

HIV-GAG質粒DNA疫苗經過檢測,符合《中華人民共和國藥典》[8]相關規程,檢測結果列于表1.由表1可見,制備的HIV-GAG質粒DNA疫苗的基因組DNA質量比低于1 μg/mg,蛋白質質量比低于2 μg/mg,內毒素質量比低于10 EU/mg,用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測表明無RNA殘留.

2.5 討 論

大規模生產DNA疫苗過程中的一個關鍵環節是菌體裂解步驟,本文采用改良后的堿裂解方法[9]破碎大腸桿菌,提高了裂解效率.加入溶液Ⅱ后應緩慢攪拌,避免局部pH值過高,過高的pH環境可使質粒DNA變性并破壞基因組DNA,導致不易分離質粒DNA(pH>12.5)[10].Urthaler等[11]研制的自動堿裂解裝置能夠溫和地堿裂解大腸桿菌細胞,從而獲得均一且穩定的質粒DNA,并能避免極端pH值的影響.本文利用低剪切槳葉攪拌也能解決該問題,裂解后向裂解液中加入高濃度的CaCl2溶液,可沉淀大部分高分子量的RNA及宿主蛋白.因此在大規模生產過程中,既可在離子交換層析前調整離子強度除去RNA[12],也可采用分子篩層析法分離RNA和DNA[13].本文采用高鹽沉淀高分子量RNA和超濾去除低分子量RNA的方法,可除去RNA、 大多數蛋白質、 內毒素及基因組DNA,提高了質粒DNA的純化效率.并采用CaptoTMcore 700凝膠介質用于純化HIV-GAG質粒DNA疫苗.

表1 HIV-DNA疫苗質量檢測結果Table 1 HIV-DNA vaccine quality test

綜上,本文通過堿裂解的方法破碎菌體,采用超濾濃縮的方法將裂解液濃縮,通過離子交換介質和復合模式凝膠過濾介質進行純化獲得了HIV-GAG藥用級質粒DNA疫苗.

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