楊艷麗 胡建國 司 岑△

胃癌是一種高死亡率的世界性惡性腫瘤[1]，其病因與致病機制研究一直為國內外學者所重視，但至今尚未明了,可能是一個多因素、多基因異常參與的過程。幽門螺旋桿菌（Hp）感染與慢性胃炎、消化性潰瘍、癌前病變及胃癌的關系已被公認。Epstein-Barr virus（EBV）是一種DNA皰疹病毒，潛伏體內可引起人B淋巴細胞系發生“永生化”，它與鼻咽癌、傳染性單核細胞增多癥、Burkitt淋巴瘤等多種疾病有關，近年研究發現EBV亦可侵犯上皮組織，在部分胃癌組織檢測到有EBV感染，其與胃癌發生的關系及機制研究已逐漸成為熱點[2]。本研究旨在探討EBV、Hp感染與胃癌的關系及二者在胃癌的發生發展過程中是否存在相互作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2011年9月—2012年9月于寧夏醫科大學總醫院行手術切除、病理確診的胃癌患者（胃癌組）100例，其中男66例，女34 例，年齡33～84歲，平均（58.67±10.33）歲，取其手術組織石蠟包埋，連續病理切片取材，厚度4～6 μm。另擇同期行胃鏡檢查、病理確診的胃炎患者（胃炎組）82例，其中男、女各41例，年齡19～80歲，平均（47.56±12.93）歲，取其內鏡活檢組織2～3塊，-80℃儲存備用。所有患者一般資料詳實，無其他腫瘤或惡性合并癥，無放化療史，無抗Hp藥物服用史。

1.2 主要儀器與試劑 組織基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.TMFFPE DNA Kit,美國），ISH-5022 EBER 原位雜交（ISH）試劑盒[包括胃酶、胃酶稀釋液、地高辛標記的EBER探針、辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗地高辛抗體、DAB稀釋液和濃縮液、PBS 緩沖液]，Taq MasterMix（包括 Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR穩定劑和增強劑），RNA-free H2O，瓊脂糖，TBE緩沖液，無水乙醇、二甲苯、溴化乙錠；病理組織切片機，恒溫水浴箱，核酸蛋白測定儀，eppendorf PCR儀，恒溫生化培養箱，BiO-RAD水平核酸電泳系統、Gel Doc XR凝膠成像儀等。

1.3 組織DNA提取質量檢測 嚴格按照基因組DNA提取試劑盒說明書提取組織DNA,并經核酸蛋白測定儀檢測,平均濃度約為152.8 mg/L，OD260/OD280比值均在1.8～2.1之間，DNA質量均合格。

1.4 引物的設計合成 分別參照文獻[3-4]設計擴增EBV基因組的特異性引物EBNA1和擴增Hp基因組的特異性引物Hp 16 S rRNA，由上海生工生物公司合成，見表1。

Table 1 The PCR primer sequences and the length of gene products表1 PCR引物序列及預計產物片段長度

1.5 聚合酶鏈反應（PCR）檢測EBV、Hp感染 PCR反應體系（25 μL）：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,上下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，RNA-free H2O8.5 μL。EBV反應條件：94℃預變性3 min、94℃變性30 s，61℃退火30 s，72℃延伸1 min（擴增30個循環）；最后72℃總延伸5 min。Hp反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸45 s（擴增30個循環）；72℃總延伸5 min。取PCR擴增產物6.0 μL經2.5%瓊脂糖凝膠110 V電壓電泳30 min，溴化乙錠染色20 min，紫外凝膠成像儀下觀察結果并記錄。

1.6 ISH技術檢測EBV編碼小RNA（EBER） （1）標本的收集和預處理：選取經PCR檢測EBV DNA表達陽性的石蠟包埋組織，顯微切割成4 μm的切片，60℃烤片過夜后用新鮮二甲苯脫蠟，然后在新鮮100%乙醇中放置數分鐘后空氣干燥。（2）酶處理：組織切片加入適量新鮮配制的胃酶工作液37℃孵育30 min，棄去胃酶工作液，逐級乙醇脫水（70%、95%和100%）各1 min，空氣干燥。（3）雜交程序：組織切片上加10 μL地高辛標記的EBER RNA探針,加蓋蓋玻片于濕盒中37℃雜交過夜，后用PBS緩沖液沖洗切片數次并使蓋玻片自然脫落。（4）檢測和顯色程序：切片上加入適量HRP酶標記的抗地高辛抗體，37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗1 min×3次；加入適量DAB工作液，顯色10 min，光鏡下觀察顯色情況；后用蒸餾水沖洗切片。（5）復染：選擇蘇木素復染10 s，蒸餾水沖洗，常規脫水、透明、封片。（6）結果判定:顯微鏡下觀察見細胞核著棕褐色者為陽性，證實為EBV感染;無細胞核著色者為陰性。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，2組指標比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗，胃癌組織中EBV與Hp感染的相關性分析采用行×列表資料的關聯性分析，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組EBV、Hp的感染 胃癌組有9例（9.0%）呈EBV感染陽性，且幾乎所有癌細胞可見濃染呈棕褐色的EBER表達陽性細胞核，胃炎組均未檢測到EBV基因，差異有統計學意義（χ2=5.967,P＜0.05）。胃癌組、胃炎組分別有56例（56.0%）、33例（40.2%）呈Hp感染陽性，胃癌組高于胃炎組（χ2=4.476,P＜0.05），見圖1～3。

Figure 1 PCR analysis of EBV DNA圖1 PCR檢測EBV DNA

1、5：Hp DNA陰性；2、3、4：Hp DNA陽性Figure 2 PCR analysis of Hp DNA圖2PCR檢測Hp DNA

2.2 EBV、Hp感染與胃癌患者臨床病理特征的關系 賁門胃體癌較胃竇癌、低分化癌較中高分化癌EBV感染率高（P＜0.05），不同性別、年齡、民族以及有無淋巴結轉移間EBV感染率差異無統計學意義。低分化癌較中高分化癌Hp感染率高（P＜0.05），不同性別、年齡、民族、發生部位及有無淋巴結轉移間Hp感染率差異無統計學意義，見表2。

Figure 3 In situ hybridization detection of EBV RNA in gastric cancer(×200)圖3 ISH檢測胃癌組織中EBV RNA表達（×200）

Table2 Correlation between EBV,Hp infection and clinical and pathological features in patients with gastric cancer表2 EBV、Hp感染與胃癌患者臨床病理特征的關系

2.3 胃癌組EBV、Hp感染的相關性 9例EBV感染陽性者中有7例（77.8%）Hp感染陽性，而91例EBV陰性者中有49例（53.8%）Hp亦呈陽性，胃癌組EBV與Hp感染間無相關性（r=0.137，P＞0.05）。

3 討論

3.1 EBV感染與胃癌 EBV屬人類皰疹病毒科γ亞科成員，最早從人Burkitt’s淋巴瘤組織中分離獲得，已證實它與多種上皮細胞疾病有關。自1990年Burke等[5]首次報道EBV與胃癌相關以來，EBV相關胃癌（EBV associated gastric cancer，EBVaGC）逐漸受到人們重視。目前檢測腫瘤細胞中EBV的主要方法是PCR和ISH技術，前者簡單、經濟，但假陽性率高，后者為確診EBV感染的金標準，但價格昂貴，綜合考慮，本研究采用2種技術協同的方法。結果顯示82例胃炎組織中均無EBV陽性表達，而100例胃癌組織中有9例呈EBV感染陽性，且幾乎所有癌細胞胞核中均可見呈棕褐色的EBER顆粒，同郭云娣等[6]研究結果一致，提示EBV感染是胃癌發生的早期危險因素，結合相關文獻，筆者推測其作用機制是：受EBV感染的上皮細胞在病毒基因組的指導下產生各種EBV相關抗原（如EBNA1、LMP2A、BARF1等），進而使胃上皮細胞的癌基因活化和抑癌基因突變或失活,促進胃上皮細胞惡性轉化而導致胃癌[7-8]，一些抑癌基因啟動子區CpG島的異常甲基化被認為是EBVaGC最早出現且最主要的分子異常表現[9-10]，但具體作用機制仍待進一步研究。本研究結果發現EBVaGC以賁門、胃體多見，且以低分化癌為主，提示此類患者惡性度較高，對胃中上部疾患（如潰瘍、癌前病變等），可考慮開展EBV篩查項目，對檢查結果陽性者定期胃鏡隨訪觀察，謹防癌變。

3.2 Hp感染與胃癌 Hp是1983年前澳大利亞學者Marshall和Warren首次分離培養發現的，已被證實Hp感染可導致慢性胃炎、消化性潰瘍等疾病的發生，并可增加潰瘍出血的風險，且與胃癌的發生關系密切[11]。本研究也表明胃癌組Hp陽性感染率高于胃炎組，提示Hp是促進胃癌發生發展的另一重要因素，考慮可能與Hp產生的大量毒性物質如尿素酶、細胞毒素相關蛋白（cagA）、細胞空泡毒素A（vacA）等有關，它們不僅可削弱胃黏膜及黏液層的屏障保護作用，還可引起各種不良反應。近期研究發現Hp破壞宿主細胞質膜,使局部的細胞外Ca2+逆流，Ca2+可促進膜聯蛋白家族成員A1和A4及細胞表面修復因子LMAP-2的表達增加，進而促進宿主細胞增殖[12]；國內也有研究證實Hp感染可以誘導胃上皮細胞染色體DNA雙鏈斷裂，進而刺激一系列染色體的修復，基因重組過程中增加了染色體錯配的概率，進而導致癌變的發生[13]。本研究結果表明低分化癌組織Hp陽性感染率顯著高于中、高分化癌組織，與相關研究結果一致[14-15]，提示Hp感染可能參與胃癌的惡性進展過程。

3.3 胃癌組織中EBV、Hp感染的相關性 目前關于EBV與Hp在胃癌發生發展中的相關性研究報道較少。有極少研究認為EBV和Hp cagA在胃癌的發生發展中具有協同作用，推測可能是Hp cagA菌定植于胃黏膜上皮細胞誘發炎性變，增加了EBV的易感性所致[16]。本研究結果顯示胃癌組織中EBV與Hp感染陽性率間無相關性，提示EBV和Hp感染可能是致胃癌發生的2個獨立危險因素，同Wang等[15]研究結果一致。

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