三七三醇皂苷對糖尿病大鼠視網膜神經節細胞的保護作用*

朱德淼 劉學政

糖尿病可誘導視網膜神經節細胞（retinal gangli?on cell，RGC）凋亡，引發糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy，DR），是成年人視力減退甚至失明的重要原因之一[1]。三七三醇皂苷（Panax notoginseng，PTS）是中藥三七的重要活性成分，可改善腦缺血所致的腦體積縮小及神經功能缺損，有明顯的神經保護作用[2-3]。本研究擬探討PTS對糖尿病大鼠視網膜RGC的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 30只SD大鼠雌雄不限，體質量200～230 g，購自遼寧醫學院實驗動物中心；PTS購自成都華神集團股份有限公司制藥廠；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、羊抗大鼠Nogo受體一抗、小鼠抗大鼠Brn3a一抗、A594-驢抗羊二抗及A488-驢抗小鼠二抗均購自美國Sigma公司；MDA試劑盒購自北京碧云天生物公司。

1.2 糖尿病模型的建立及實驗分組 動物隨機分為對照組、糖尿病組和治療組，每組10只。糖尿病組和治療組腹腔注射1%STZ溶液（60 mg/kg），48 h后尾靜脈取血測血糖，若大于16.7 mmol/L即為模型建立成功。治療組給予PTS 50 mg·kg-1·d-1灌胃給藥，每日2次。對照組及糖尿病組給予等劑量生理鹽水。1個月后進行指標檢測。

1.3 Nogo受體及Brn3a熒光免疫組化雙標 快速摘除大鼠雙側眼球，于解剖顯微鏡下，以眼科剪沿角膜緣剪開眼球，去除角膜、晶狀體及玻璃體，剝離視網膜，濾紙吸干后稱質量。常規制備視網膜石蠟切片，脫蠟至水化。以羊抗大鼠Nogo受體/小鼠抗大鼠Brn3a一抗混合液于4℃孵育48 h，均稀釋為1∶200（Brn3a為RGC特異性標志物），再以A594-驢抗羊/A488-驢抗小鼠二抗混合液孵育室溫4 h（均稀釋為1∶500），封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.4 Western blot檢測Nogo受體表達 將視網膜以4℃生理鹽水制備1%濃度組織勻漿。蛋白裂解液裂解后以12 000 r/min離心15 min，上清液以80 V電壓聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法移至PVDF膜，以Nogo受體及β-actin一抗于37℃分別孵育2 h，再以辣根過氧化物酶標記的二抗室溫分別孵育1 h，試劑盒顯影。Nogo與β-actin條帶光密度值之比即為Nogo受體相對表達量。

1.5 視網膜丙二醛（MDA）含量檢測 以4℃生理鹽水制備5%的視網膜勻漿，4 000 r/min離心10 min后取上清，按試劑盒提供的操作步驟及公式，利用硫代巴比妥酸法檢測視網膜中MDA含量。

1.6 視網膜HE染色 常規制備視網膜石蠟切片，脫蠟入水，經蘇木精染色、分色、水洗、乙醇伊紅染色液染色、乙醇逐級脫水及二甲苯透明等常規步驟，封片后鏡下觀察，每個視網膜隨機讀取3個視野，計數3次，取平均值，計算各組RGC密度。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件對實驗結果進行統計學處理，數據以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血糖水平 造模48 h后，糖尿病組及PTS治療組血糖明顯高于對照組（均P＜0.001），糖尿病模型構建成功，見表1。

Table 1 Comparison of blood glucose，expression of Nogo receptor,the level of MDA,and density of RGC between three groups表1 3組大鼠血糖、視網膜Nogo受體表達、MDA含量及RGC密度比較 （n=10，x±s）

2.2 Brn3a和Nogo受體表達情況 熒光免疫組化雙標顯示，Brn3a與Nogo受體于視網膜內大量共存，見圖1。

2.3 PTS對糖尿病大鼠視網膜Nogo受體表達的影響 糖尿病組Nogo受體表達水平明顯高于對照組和治療組，差異有統計學意義（P＜0.001），見表1、圖2。

Figure 2 Expression levels of retinal Nogo receptor in three groups圖2 各組視網膜Nogo受體表達

2.4 PTS對糖尿病大鼠視網膜MDA含量的影響 3組間MDA含量差異有統計學意義（P＜0.01），糖尿病組高于對照組和治療組（均P＜0.001），見表1。

2.5 PTS對糖尿病大鼠RGC密度的影響 糖尿病組視網膜神經節細胞層RGC密度較對照組和治療組明顯減少（P＜0.001），見表1、圖3。

3 討論

糖尿病累及視網膜即發生DR，視網膜RGC受損是DR患者視力減退的重要原因[4]。糖尿病患者DR發病率高，即使嚴格控制血糖也不能完全防治DR，患者仍有視力減退甚至失明的危險。糖尿病病程5年患者DR發病率約為44.4%，7年約為56%左右，10年約60%，15年則高達80%[5-6]。預計2030年全球糖尿病患者將達3億6千萬[7]，DR已經成為成年人致盲的重要因素[8]。

三七是一種傳統中藥，PTS是三七的重要活性成分之一。本研究發現，糖尿病大鼠視網膜RGC數量明顯減少，給予PTS可恢復糖尿病大鼠視網膜RGC數量，表現出了明顯的神經保護作用。

PTS保護缺血腦神經元的機制尚不完全清楚，可能與PTS抑制神經元Nogo受體及其配體Nogo-A的表達，促進腦缺血后的神經再生有關[2-3]。Nogo受體是一種髓磷脂相關蛋白，可抑制神經再生，在視網膜僅表達于RGC細胞內[9]。本研究也發現，Nogo受體與Brn3a在視網膜內大量共存，僅表達于視網膜RGC內。青光眼時視網膜RGC細胞Nogo受體表達增加，抑制Nogo受體表達可抑制RGC細胞凋亡，Nogo受體表達增加是視網膜RGC凋亡的重要機制之一[10]。本研究結果顯示，PTS恢復糖尿病大鼠視網膜RGC數量的同時，視網膜Nogo受體表達減少，提示下調Nogo受體表達可能是PTS保護糖尿病視網膜RGC的重要機制之一。

Nogo受體抑制細胞凋亡的機制復雜，可影響線粒體膜電位，是細胞氧自由基堆積，導致凋亡的重要因素之一[11]。因此，Nogo受體可能通過氧自由基堆積誘導RGC細胞凋亡。高血糖可誘發氧化應激，MDA水平是氧化應激的重要指標之一。本研究表明，糖尿病時視網膜MDA水平增高，說明糖尿病視網膜氧化應激明顯。PTS下調糖尿病大鼠視網膜Nogo受體表達的同時，伴有視網膜MDA含量的降低，表明PTS下調糖尿病大鼠視網膜Nogo受體表達的同時可降低視網膜氧化應激水平。因此，PTS可能通過下調RGC內Nogo受體的表達，抑制RGC氧化應激反應，從而對糖尿病視網膜RGC發揮保護作用。

本研究證實了PTS對糖尿病大鼠視網膜RGC的保護作用，并研究了作用機制，為DR的臨床治療提供了思路，但DR發病機制復雜，PTS在DR防護中的作用仍需深入探討。

Figure 1 Colocalization of Brn3a and Nogo receptor in retina(immunofluorescence histochemical double-staining×200)圖1 Brn3a與Nogo受體在視網膜內的共存（熒光免疫組化雙標,×200）

Figure 3 Photos showing the number of RGC in three groups of diabetic rats(HE staining，×200)圖3 3組糖尿病大鼠RGC密度（HE染色，×200）

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