比阿培南開環物雜質的確證及含量測定Δ

陳松杰，王德剛，張 莉，鐘雅妮（珠海聯邦制藥股份有限公司，廣東中山 528467）

比阿培南（Biapenem）是一種新型1β-甲基碳青霉烯類抗生素，具有抗菌譜廣、對腎脫氫肽酶穩定、藥動學參數優良、臨床治療效果好、耐受性好和不良反應少等特點[1]。目前各國藥典均未收載比阿培南。經分析其主要降解產物為聚合物和開環物，文獻[2-6]中多對其聚合物進行研究，對其開環物的研究鮮有報道。而從比阿培南聚合物的產生途徑可知，其開環物可與比阿培南反應生成二聚物，故對開環物進行控制可在一定程度上降低聚合物產生的可能性。

筆者另查閱注射用Omegacin的說明書[7]知，原研品中可能存在的雜質包括2個開環物，現暫命名為比阿培南開環物A和開環物B，且開環物A為比阿培南體內代謝產物。本文通過試驗建立了測定比阿培南開環物雜質的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法，并采用色譜-質譜（LC-MS）方法對其結構進行確證，同時考察了自制樣品及原研品中開環物雜質的含量水平。

1 材料

LC-20AT型HPLC儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；AE240型電子天平（瑞士Mettler toledo公司）；6120型單四級桿液質聯用儀（美國Agilent公司）。

比阿培南原料藥（自制，批號：4031204001、4031204002、4031204003，純度：99.96%、99.96%、99.95%）；注射用比阿培南（原研品，日本明治制果制藥株式會社，批號：4004，測定時已近效期，規格：每支0.3 g）；比阿培南開環物B雜質對照品（自制，經質譜、元素分析及核磁共振氫譜確證其結構，批號：120703，純度：99.8%）；由于比阿培南開環物A雜質對照品獲得較為困難，因此擬取其HPLC洗脫成分采用LC-MS方法確證其結構；乙腈為色譜純，水為自制超純水，其他各試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

HPLC色譜條件：色譜柱為Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.01 mol/L四丁基溴化銨溶液-乙腈-三乙胺（980∶20∶2，用磷酸調節pH值至6.0），流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30℃。

LC-MS色譜條件：色譜柱為GL Sciences C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為0.01 mol/L醋酸銨溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，柱溫為30℃。按表1進行線性梯度洗脫。

表1 線性梯度洗脫表Tab 1 Linear gradient elution

質譜條件：電噴霧離子源（ESI）；正離子模式采集數據；選擇一定質荷比（m/z）范圍內的全掃描，m/z為100～800；氮氣流速為10 L/min，霧化器壓力為35 psig，干燥氣體溫度為300℃，毛細管電壓為4.0 kV。

2.2 溶液的制備

2.2.1 系統適用性試驗溶液制備。取比阿培南原料藥（批號：4031204001）約15 mg，置于10 ml量瓶中，加適量流動相溶解后，于80℃水浴破壞15 min，放冷至室溫，加5%甲酸溶液0.5 ml，再加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得含有比阿培南2個開環物雜質的溶液，作為系統適用性試驗溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備。取供試樣品適量，精密稱定，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 ml中含1.5 mg的溶液，作為供試品溶液（臨用新制）。

2.2.3 對照溶液的制備。精密量取供試品溶液適量，加流動相定量稀釋制成15 μg/ml的溶液，即得。

2.2.4 比阿培南開環物A定位溶液的制備。取系統適用性試驗溶液繼續水浴破壞，同時增加進樣體積，在檢測器出口處收集第1個峰面積顯著增大的雜質的洗脫成分，即得。

2.2.5 比阿培南開環物B對照品溶液的制備。取比阿培南開環物B雜質對照品適量，加流動相溶解，搖勻，即得。

2.3 系統適用性試驗溶液破壞條件的確定

比阿培南結構中的內酰胺環不穩定，在高溫、酸或堿條件下易開環，降解為比阿培南開環物A；且開環后產生的—COOH基不穩定易脫去生成甲酸，甲酸使比阿培南開環，并與五元環上的—NH結合產生開環物B。因此選擇一定量的甲酸為破壞溶劑進行試驗。取系統適用性試驗溶液20 μl注入色譜儀，記錄色譜圖，主峰后峰面積顯著增大的2個雜質峰依次為比阿培南開環物A、B。主峰與比阿培南開環物A色譜峰的分離度應大于1.5。

比阿培南可能降解的途徑如圖1所示：

圖1 比阿培南開環物可能的降解途徑Fig 1 Potential degradation pathway of biapenem openring impurities

2.4 比阿培南開環物的結構確證

取系統適用性試驗溶液，進行LC-MS聯用分析，結果檢出2個較大的降解雜質峰，保留時間約為3.8 min的雜質準分子離子峰的m/z分別為369、325，與[M+H]+、[M-COOH+H]+對應，即m/z為369的峰分子質量為368，與比阿培南開環物A的分子質量368一致；m/z為325的峰為比阿培南開環物A的碎片離子，因比阿培南開環后—COOH基易脫去，形成該碎片離子；保留時間約為5.4 min處的雜質準分子離子峰[M+H]+的m/z為397，即m/z為397的峰分子質量為396，與比阿培南開環物B分子質量396一致，且其保留時間及m/z均與比阿培南開環物B對照品一致。表明系統適用性試驗溶液中降解產生的2個較大雜質分別為比阿培南開環物A、B，詳見圖2。

圖2 降解雜質經LC-MS結構確證分析結果A.總離子流圖；B.開環物B的MS圖；C.開環物A的MS圖；1.比阿培南；2.開環物A；3.開環物BFig 2 LC-MS analysis results of structural identification of impurity by degradationA.TIC；B.MS chromatograms of open-ring impurity B；C.MS chromatograms of open-ring impurity A；1.biapenem；2.open-ring impurity A；3.open-ring impurity B

2.5 比阿培南開環物在2種色譜系統中的相互識別

通過對比2種色譜系統中雜質含量，結果系統適用性試驗溶液在HPLC色譜系統中的2個峰面積顯著增大的雜質，分別與LC-MS系統下峰面積顯著增大的雜質含量基本吻合，兩者存在對應關系；另采用開環物B雜質對照品在HPLC色譜系統進行定位，可證明第2個顯著增大的雜質即為比阿培南開環物B；收集HPLC色譜系統系統適用性試驗溶液中第1個顯著增大雜質的洗脫成分，再在LC-MS系統中進樣測試，其保留時間與比阿培南開環物A一致，且其分子質量為368，與比阿培南開環物A分子質量亦一致，可證明第1個顯著增大的雜質即為比阿培南開環物A。

由此說明，LC-MS系統檢出分子質量為368和396的雜質，分別與HPLC色譜系統檢出的2個雜質為同一物質，即HPLC色譜系統中此2個雜質分別為比阿培南開環物A、B。

2.6 比阿培南開環物A、B的含量測定

2.6.1 系統耐用性試驗及開環物峰位的確定。照“2.1”項下HPLC色譜條件，取系統適用性試驗溶液，分別采用Thermo Hypersil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和大連依利特ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種不同廠家色譜柱，在不同儀器上進行試驗。結果系統適用性試驗溶液中開環物A與比阿培南的分離度均大于1.5，開環物B保留時間與開環物B對照品一致；且比阿培南開環物A和B均增加明顯，便于對雜質進行定位，方法可行，耐用性好。因此采用系統適用性試驗溶液對開環物進行定位。

2.6.2 專屬性試驗及開環物降解途徑考察。取比阿培南原料藥（批號：4031204001）適量，分別經水浴和5%甲酸溶液（系統適用性試驗溶液）、高溫（80℃）、光照[（4500±500）lx]、高濕（相對濕度92.5%）及原料藥溶液經85℃水浴破壞后制成的溶液進樣分析；同時取比阿培南開環物B對照品適量，加流動相制成一定質量濃度的溶液進樣分析，記錄色譜圖，考察方法專屬性。空白（流動相）、開環物B對照品及樣品經高溫、高濕、光照、水浴及強酸破壞后的色譜見圖3。

圖3 方法專屬性考察HPLC圖譜A.空白（流動相）；B.樣品；C.系統適用性試驗溶液；D.高溫破壞后樣品；E.光照破壞后樣品；F.高濕破壞后樣品；G.水浴破壞后樣品；H.開環物B對照品；1.比阿培南；2.開環物A；3.開環物BFig 3 HPLC chromatograms of method specificityA.blank（mobile phase）；B.sample；C.solution of system suitability test；D.sample destroyed by high temperature；E.sample destroyed by light；F.sample destroyed by humidity；G.sample destroyed by water bath；H.open-ring impurity B control；1.biapenem；2.open-ring impurityA；3.open-ring impurity B

結果表明，樣品水溶液在水浴破壞條件下，開環物A增加顯著，但未降解產生開環物B；經水浴及強酸破壞（即系統適用性試驗溶液）后，開環物A及開環物B均增加顯著；高溫、高濕及光照條件下開環物A、B均未顯著增加，表明在此幾種條件下開環物不易產生。降解產生的開環物B雜質與其對照品保留時間一致；空白溶劑不影響比阿培南及其開環物的檢出；各降解雜質均能與開環物分離完全。本色譜系統專屬性良好。因系統適用性試驗即是在酸性環境下使比阿培南水解，試驗結果表明水解產物對測定無干擾，故專屬性試驗不再考察酸堿水解對測定的干擾。

2.6.3 線性關系試驗。精密稱取比阿培南原料藥（批號：4031204001）和比阿培南開環物B對照品適量，加流動相溶解后，再加流動相定量稀釋制成系列質量濃度分別為0.077、0.155、0.309、0.464、0.773、1.237、1.546 mg/ml和 0.765、1.53、3.06、4.59、7.65、12.24、15.30、22.95 μg/ml的混合溶液，搖勻，即為線性試驗溶液。進樣測試，將測得的峰面積（y）與質量濃度（x）作線性回歸。結果比阿培南的線性方程為：y＝758510x－1021662（r＝0.9955）；比阿培南開環物B的線性方程為：y＝1172380x－2703（r＝0.9999）。表明比阿培南與比阿培南開環物B檢測質量濃度線性范圍分別為0.077～1.546 mg/ml、0.765～22.95 μg/ml。

2.6.4 定量限及檢測限試驗。取“2.6.3”項下線性試驗溶液，逐步稀釋制成一定質量濃度的溶液，進樣測試。得比阿培南與比阿培南開環物B的定量限（信噪比約為10∶1）分別為2.1、2.3 ng，檢測限（信噪比約為3∶1）分別為0.6、0.9 ng。

2.6.5 比阿培南開環物B回收率試驗。精密稱取比阿培南開環物B適量，加流動相溶解并制成0.15 mg/ml的溶液，作為雜質貯備液。再精密稱取本品9份，各約30 mg，分別置于9個20 ml量瓶中，分3組，各3份，每組分別加入精密量取的雜質貯備液（0.15 mg/ml）1.6、2.0、2.4 ml，再加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為比阿培南開環物B回收率試驗的供試品溶液（按比阿培南開環物B的限度為1.0%進行加樣回收試驗）；另取雜質貯備液適量，加流動相制成0.015 mg/ml的溶液，作為比阿培南開環物B對照品溶液。精密量取上述供試品溶液及對照品溶液各20μl，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。結果，比阿培南開環物B的平均回收率為100.5%，RSD＝0.7%（n＝3），樣品對此雜質的測定無干擾，本方法準確性良好。

2.6.6 樣品測定結果。取自制的3批比阿培南原料藥及原研品1批，照“2.1”項下色譜條件，取對照溶液20 μl，注入色譜儀，調節檢測靈敏度，使主峰的峰高約為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液和對照溶液各20 μl，分別注入色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時間的5倍。開環物A、B含量均采用自身對照法計算，結果見表2。

表2 4批樣品開環物雜質的含量測定結果Tab 2 Content determination of open-ring impurities in 4 batches of samples

3 討論

Nan Wang等[8]建立了比阿培南及雜質質控的HPLC分析方法，該方法利用HPLC-二極管陣列檢測器（DAD）數據，采用二維色譜光譜相關分析技術及軟件，在無雜質對照品的情況下，實現了質控分析HPLC-紫外（UV）色譜中的色譜峰與LCMS色譜圖中的色譜峰的相互識別。結果表明比阿培南水解產生的雜質主要為開環物及二聚物，暫命名為比阿培南開環物A及C、比阿培南二聚物A及B。

本文則采用系統適用性試驗溶液，在HPLC系統下即可對比阿培南開環物A及B進行定位，不依賴于LC-MS，更適用于日常檢驗。本文方法與文獻[8]方法的條件比較見表3。

綜上，本文建立的方法可對比阿培南的2個開環物雜質進行有效分離，方法專屬強、靈敏度高，可滿足雜質測定要求，因此本法可作為比阿培南中開環物的質控方法。同時，通過系統適用性試驗，對特定雜質開環物A和B進行定位，不需要提供雜質對照品，操作方法簡便，并可有效保證產品質量安全。

表3 2種分析方法的比較Tab 3 Comparison of 2 kinds of analysis methods

[1]趙敏，趙國君，張勇.新碳青霉烯類抗生素比阿培南[J].中國臨床藥理學雜志，2005，21（5）：390.

[2]張菁，邢亮彬.HPLC法測定注射用比阿培南的含量及有關物質[J].中國抗生素雜志，2006，31（9）：565.

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[5]王蓓，張菁，馬衛紅.注射用比阿培南的有關物質測定方法研究[J].現代中西醫結合雜志，2010，19（10）：1247.

[6]劉俊華，張莉，程玉寶，等.HPLC法測定比阿培南二聚物方法研究及其降解途徑考察[J].藥物分析雜志，2012，32（3）：468.

[7]明治制果制藥株式會社.注射用Omegacin 0.3g[EB/OL].（2013-02）[2013-04-15].http：//www.info.pmda.go.jp/.

[8]Nan Wang，Chun-Feng Li，Dou-Sheng Zhang，et al.Establishment of an HPLC method for the analysis of biapenem an its impurities[J].Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，2011，20（2）：171.