先天性肛門直腸畸形合并少見型手足畸形一家系調(diào)查及其病因研究

蘇朋俊，袁宇航，張志波，黃英，王大佳

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院小兒外科，沈陽110004）

肛門直腸畸形（anorectal malformations，ARM）是小兒常見的先天性消化道畸形，發(fā)生率約為1/5000～1/1500，病因及胚胎形成機制至今未完全闡明。目前認為，肛門直腸畸形的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，流行病學和動物實驗表明，遺傳因素在其發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［1，2］。

由于肛門直腸畸形發(fā)病復雜，常常合并有其他畸形，其遺傳方式多種多樣，因而對其致病基因的研究進展緩慢。以往許多學者在總結(jié)家族性肛門直腸畸形病例基礎上，對肛門直腸畸形的遺傳方式進行分析和推測。鑒于肛門直腸畸形發(fā)病復雜，且常常合并其他畸形，將其分為非綜合征型和綜合征型，認為非綜合征型肛門直腸畸形或合并輕微畸形（如手指、足趾畸形等）的肛門直腸畸形遺傳方式可能是多基因遺傳；而綜合征型肛門直腸畸形，尤其作為某一綜合征的一部分出現(xiàn)時，其遺傳方式取決于該綜合征［3］。因此，對于綜合征型肛門直腸畸形家系進行連鎖分析，能夠?qū)⒑蜻x基因定位于染色體的特定區(qū)帶，并進行更詳細的定位。

我們發(fā)現(xiàn)了1個先天性肛門直腸畸形家系，先證者及其父親同時患有缺指裂掌畸形（split handfoot malformation，SHFM），鑒于該家系同時患有肛門直腸畸形手和手足畸形的特殊性，我們對該家系進行了全面調(diào)查，并應用分子生物學技術(shù)對其病因進行了初步研究，以闡明基因型與表型之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

遼寧省某市1個先天性肛門直腸畸形合并手足畸形家系（圖1）；先證者Ⅳ1是家族中出現(xiàn)的第3位患者，此家系中共出現(xiàn)3名患者，2009年曾對該家系中3例患者及部分正常個體做全面的體格檢查，征得患者同意后，在無菌條件下分兩次采集先證者及其家庭成員（Ⅱ1，2，Ⅲ1-4，Ⅳ1，2）的外周靜脈血各5 mL，并采集其他100名正常人的外周靜脈血作為正常對照組。

1.2 細胞遺傳學檢查

在無菌條件下2次接種1640細胞培基，作血細胞培養(yǎng)2次，按常規(guī)方法制片、G顯帶，各在Olypus雙目顯微鏡下計數(shù)100個中期分裂相，分析10個核型。

1.3 基因突變的鑒定

應用Blood Genome DNA Extraction Kit（TaKaRa Code：D9081），并按照其說明，從8名家系成員和100名正常人的外周靜脈血分離基因DNA。候選基因引物序列如表1所示。PCR反應體系：在0.25 mL Eppendorf管中加入下列試劑：10×PCR buffer（Mg2+Plus）5 μL；10 mmol/L dNTP 4 μL；10 μmol/L 引物1（正向鏈）0.5 μL；10 μmol/L引物2（反向鏈）0.5 μL；10 ng/μL 基因組 DNA 8 μL；滅菌去離子水31.5 μL；5 U/μL TaKaRa Taq0.5 μL 混勻。將上述擴增片段經(jīng)純化后，分別亞克隆進ZeroBlunt Topo PCR載體上（Invitrogen，CA，USA），分別進行雙向測序。應用Blast對所得序列進行比較和分析，并與人類基因庫中的基因序列進行比較。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

該家系連續(xù)3代3人均患有畸形程度進行性加重的肛門直腸畸形及手足畸形，分別為先證者（Ⅳ1）、其父親（Ⅲ3）及其爺爺（Ⅱ2）。先證者（Ⅳ1）因中位鎖肛、直腸尿道瘺在我院行會陰肛門成形閉瘺術(shù)。Ⅱ2、Ⅲ3出生后即在當?shù)蒯t(yī)院因鎖肛會陰瘺行會陰肛門成形術(shù)。先證者（Ⅳ1）：4 d，右手第2、3指缺如，左手第3、4指并指，左足第3、4趾并趾（圖2A、2B、2C）。Ⅲ3：34歲，右手第3指缺如、裂掌畸形（圖2D）；Ⅱ2：60歲，右手第3、4指并指畸形（已手術(shù)糾正），手指長度無明顯異常，掌指關(guān)節(jié)及指關(guān)節(jié)活動正常；先證者Ⅳ1（目前3歲）、Ⅲ3、Ⅱ2身高與常人無明顯區(qū)別，智力發(fā)育正常，營養(yǎng)中等，身高與常人相似，牙、頭發(fā)、指甲、皮膚、乳腺、口唇和眼睛等檢查未見異常。

2.2 染色體核型分析結(jié)果

染色體G顯帶分析結(jié)果顯示，先證者（Ⅳ1）、其父親（Ⅲ3）及其爺爺（Ⅱ2）核型均為 46，XY，未見染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。

2.3 P63基因突變

患者與該家系其他5名表型正常成員及正常對照組的擴增片段大小一致，然而將患者的擴增片段DNA序列分別與該家系表型正常成員和正常對照組以及人類基因庫DNA序列進行比較時，則發(fā)現(xiàn)在P63基因第6外顯子的第797位堿基對發(fā)生雜合性突變，即由G突變?yōu)锳（圖3），密碼子CGA->CAA，該突變結(jié)果導致P63基因第6外顯子第227位氨基酸由精氨酸->谷氨酰胺，為錯義突變。

3 討論

SHFM是一種嚴重的先天性肢端畸形，其在新生兒中發(fā)病率為1/（8500～25000），占肢端缺陷癥新生兒的8%～17%，表現(xiàn)為正中軸指（趾）發(fā)育不全而剩余指（趾）呈不同形式的融合，形成手足中央裂的疾病表型，常常伴發(fā)其他器官缺陷，其伴發(fā)率達40%，故根據(jù)癥狀發(fā)生是否伴隨其他器官缺陷分為綜合征型與非綜合征型［4］。我們所報道的該家系，手足畸形及其合并的肛門直腸畸形表型具有一定的變異，Ⅱ2僅表現(xiàn)為低位鎖肛會陰瘺合并輕度的肢體畸形；Ⅲ3除患有鎖肛會陰瘺外，右手第3指缺如、裂掌畸形；Ⅳ1表現(xiàn)為中位肛門直腸畸形、直腸尿道瘺，右手第2、3指缺如，左手第3、4指并指，左足第3、4趾并趾，肛門直腸及肢體畸形進行性加重，但該家系無外胚層發(fā)育不良或唇腭裂表現(xiàn)，查閱國內(nèi)外文獻，尚沒有相關(guān)報道，故該家系SHFM合并肛門直腸畸形可能為1個新的綜合征表現(xiàn)型。

目前手足裂畸形已經(jīng)定位至5個遺傳位點：SHFM1（MIM183600）、SHFM2 （ MIM313350）、SHFM3 （MIM 600095）、SHFM4（MIM 605289）和SHFM5（MIM 606708），分別位于人類染色體 7q21、Xq26、10q24、3q27 和2q31，候選基因包括 DLX5/DLX6、FHL1、DAC、P63、HOXD13［4］，故我們特定設計候選基因外顯子引物序列，將患者的擴增片段DNA序列分別與該家系表型正常成員和正常對照組以及人類基因庫DNA序列進行比較時，發(fā)現(xiàn)在P63基因第6外顯子的第797位堿基對發(fā)生雜合性突變，即由G突變?yōu)锳，密碼子CGA->CAA，該突變結(jié)果導致P63基因第6外顯子第227位氨基酸由精氨酸->谷氨酰胺，為錯義突變。

P63基因是P53基因家族中的成員之一，位于3號染色體，在先天性缺指（趾）畸形、外胚層發(fā)育不良、唇裂腭裂綜合征、SHFM等人類疾病中均存在p63基因顯性突變［4］。R227是P635個熱點突變之一，至今已在27例唇裂腭裂綜合征和1例肢體乳綜合征患者中發(fā)現(xiàn) P63 發(fā)生 R227Q 突變［5，6］，但該位點突變與其他位點突變有所不同，表現(xiàn)為：（1）在這些患者中常常外胚層發(fā)育不良表型較輕，很少合并有唇/腭裂、下肢缺陷，且無并指畸形；（2）通常合并有前置肛門或肛門狹窄、會陰體發(fā)育不良、腎臟和泌尿系畸形；（3）以往的研究認為，P63熱點突變發(fā)生在DBD區(qū)（包括R227），進而減弱P63蛋白與DNA的結(jié)合活性，但有研究發(fā)現(xiàn)R227Q位點突變并不能影響與候選基因的結(jié)合力［7］；（4）R227位點是P63突變熱點中唯一沒有P53同源突變位點；這些特點提示R227Q區(qū)別于其他熱點突變，R227Q的作用機制可能不同于其他突變位點。

近年來通過動物實驗進一步揭示了P63對細胞、組織和器官發(fā)育的意義。P63特定地在胚胎外胚層和中胚層及上皮組織的再生層表達，是外胚層、面部、膀胱泌尿生殖器、直腸和四肢發(fā)育的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；P63基因缺陷的小鼠出生后四肢截短，毛囊、牙齒、淚腺或唾液腺、皮膚、前列腺、乳腺和尿道上皮、膀胱壁缺如、泄殖腔畸形和肛門閉鎖等結(jié)構(gòu)畸形［8，9］。P63 下游調(diào)控基因 DLX5、BMP7 等也參與了消化道末端的發(fā)育，敲除DLX5、BMP7基因的小鼠出現(xiàn)尾端的發(fā)育不良、泄殖腔畸形［10，11］。此外，P63還參與了與肛門直腸畸形發(fā)生相關(guān)的Shh、Gli2、Bmp4、Fgf10等基因的調(diào)控［12］。這些相關(guān)基因形成龐大的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，P63是這個網(wǎng)絡的重要一環(huán)，在先天性肛門直腸畸形的發(fā)生中可能具有重要作用。

綜上所述，肛門直腸畸形合并缺指裂掌畸形可能為一新的綜合征表現(xiàn)型，由P63基因第6外顯子基因組的第797位堿基對突變所致，P63基因表達異常可能與先天性肛門直腸畸形發(fā)生存在相關(guān)性。

［1］Herman RS，Teitelbaum DH.Anorectal malformations［J］.Clin Perinatol，2012，39（2）：403-422.

［2］Stoll C，Alembik Y，Dott B，et al.Associated malformations in patients with anorectal anomalies［J］.Eur J Med Genet，2007，50 （4）：281-290.

［3］Marcelis C，de Blaauw I，Brunner H.Chromosomal anomalies in the etiology of anorectal malformations：a review［J］.Am J Med Genet A，2011，155A（11）：2692-2704.

［4］Luo T，Yu W，Yuan Z，et al.A novel mutation of p63 in a Chinese family with inherited syndactyly and adactylism［J］.Mutat Res，2008，637（1-2）：182-189.

［5］Sripathomsawat W，Tanpaiboon P，Heering J，et al.Phenotypic analysis of Arg227 mutations of TP63 with emphasis on dental phenotype and micturition difficulties in EEC syndrome［J］.Am J Med Genet A，2011，155A（1）：228-232.

［6］Maclean K，Holme SA，Gilmour E，et al.EEC syndrome，Arg227Gln TP63 mutation and micturition difficulties：is there a genotype-phenotype correlation?［J］.Am J Med Genet Part A，2007，143A（10）：1114-1119.

［7］Koster MI.P63 in skin development and ectodermal dysplasias［J］.J Invest Dermatol，2010，130（10）：2352-2358.

［8］Cheng W，Jacobs WB，Zhang JJ，et al.△Np63 plays an anti-apoptotic roleinventralbladder［J］.Development，2006，133（23）：4783-4792.

［9］Ching BJ，Wittler L，Proske J，et al.p63（TP73L）a key player in embryonic urogential development with significant dysregulation in human bladder exstrophy tissue［J］.Int J Mol Med，2010，26（6）：861-867.

［10］Wu X，F(xiàn)errara C，Shapiro E，et al.Bmp7 expression and null phenotype in the urogenital system suggest a role in re-organization of the urethral epithelium［J］.Gene Expr Patterns，2009，9（4）：224-230.

［11］Suzuki K，Haraguchi R，Ogata T，et al.Abnormal urethra formation in mouse models of split-hand/split-foot malformation type1and type 4［J］.Eur J Hum Genet，2008，16（1）：36-44.

［12］Liu G，Moro A，Zhang JJ，et al.The role of Shh transcription activator Gli2 in chick cloacal development［J］.Dev Biol，2007，303（2）：448-460.