痛風性關節炎動物模型制備的研究

李 澤，張記恩，榮 俊 （長江大學臨床醫學院，湖北 荊州434000）

痛風性關節炎是由于尿酸納結晶體沉積在關節腔內引起的一種炎癥反應，臨床上以腫脹、疼痛、發熱為主要表現［1］。目前，痛風性關節炎的發病率逐漸上升，發病低齡化，對其病因與遺傳學的研究及臨床治療逐漸成為大家重視的問題。但目前痛風性關節炎的動物模型的制備尚不成熟，與人類痛風性關節炎的發病機制相比穩定性較差。本實驗依據Mc Carty法造模，建立SPF雞痛風模型，評估人工痛風模型建立的效果，以便對新型藥物治療痛風提供實驗室依據，并為臨床上治療痛風性關節炎提供新的方向和參照。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF白來航雞30只 （雄性），雞齡2～3月，體質量1800～2500g，代謝籠：由本院提供。實驗室：溫度濕度穩定、干潔、通風。實驗前實驗室標準條件下常規飼養1周。

1.1.2 主要藥物 尿酸鈉晶體Sigma公司生產；生理鹽水 （美國Aldrich公司）；PZA （美國Sigma公司）；苯溴馬璉 （德國赫曼大制藥廠）。

1.2 動物分組與給藥方法

SPF雞實驗室標準條件下常規飼養1周。SPF雞30只隨機分為兩組，模型組25只和正常對照組5只。采用Mc Carty經典方法造模，即將SPF雞腿部備皮 （左側），常規消毒皮膚，輕度屈曲關節，關節正中進針，將配置好的2%尿酸鈉溶液以0.5ml／kg通過膝關節后側韌帶注入公雞膝關節腔。正常對照組注射等容積生理鹽水。每3d注射1次，連續注射4次。于注射前、注射后5、24、48h后仔細觀察受試關節的形態變化 （局部紅腫程度、皮膚溫度變化、關節活動度），分別詳細記錄以上4個階段時受試關節患側、健側的周徑及皮膚溫度差值。第6周取血后處死SPF雞，按外科學鈍性分離法取出受試雞健、患側膝關節軟骨及滑膜組織，切成約1mm厚的切片行病理學檢查。

1.3 觀察指征

①精神狀態以及活動情況，飲食、體質量、毛色、皮溫、關節皮色、腫脹程度、行走狀況和關節液變化情況等等。②膝關節周徑的測量以及腫脹指數的計算。③光學顯微鏡下觀察關節滑液細胞種類及數量以及變化情況。④病理學報告以及炎癥程度記分。

2 結 果

2.1 一般情況觀察

實驗前1周模型組和正常對照組精神好，食欲佳，活潑好動，毛色光澤，體質量按正常增長。局部常規注射尿酸鹽后，模型組雞皮毛干枯發黃，倦怠懶動緩慢，進食逐漸量少，出現便秘2只，體質量逐漸下降3只，其余7只體質量增長緩慢。用藥后觀察1～6h，模型組雞活動、攝食水明顯減少，關節局部膚溫升高，正常對照組于實驗前無明顯差異；模型組與實驗前相比變化顯著。正常對照組5只步態均為0級，而模型組25只步態呈現Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級分別為12、6、7只，無0級步態。

圖1 正常軟骨組織

2.2 兩組關節周徑變化

兩組關節周徑變化見表1。正常對照組用藥前后關節周徑差異無統計學意義（P＞0.05），模型組用藥后周徑增加明顯，用藥前后比較有統計學差異（P＜0.05）。模型組關節周徑增加明顯，高于正常對照組（P＜0.05），表明局部注射尿酸鹽較好地復制痛風模型。

表1 造模前后各組關節周徑變化

2.3 組織病理改變

正常對照組：病理學改變不明顯，關節周圍組織結構正常 （見圖1、2、3）。

模型組：明顯的關節炎病理改變，關節周圍異物肉芽腫形成，其間有大量異物多核巨細胞，成纖維細胞增生，毛細血管增生，排列紊亂。尿酸鹽結晶可在標本取出時大體觀察到 （如圖4、5）。

圖3 正常腎小管上皮細胞

圖4 病變軟骨組織

模型組電鏡顯示：腎近曲小管上皮細胞結構紊亂，細胞表面微絨毛形態不規則；正常對照組：腎小管上皮細胞線粒體結構正常 （圖6）。X線下可見：正常對照組關節間隙正常，無鈣化影，無骨質破壞，關節面平整 （圖7）；模型組可見關節間隙狹窄，骨質破壞，可見不規則團塊狀鈣化影 （圖8）。

圖5 病變滑膜組織

圖6 病變腎小管上皮細胞

圖7 正常X線表現

圖8 病變X線表現

2.4 血尿酸水平的變化

用藥前，各組SPF雞血尿酸水平無統計學差異（P＞0.05）。用藥后，模型組SPF雞血尿酸值由（108.9±10.11）μmol／L升高到 （301.8±24.7）μmol／L，與用藥前比較均有統計學差異 （P＜0.05）。表明局部注射尿酸鹽可以復制痛風發作模型，為臨床治療痛風打下實驗基礎。

3 討 論

痛風是一種代謝性疾病。成人血尿酸的正常濃度為90～420μmol／L，其水溶性差，超過此范圍即會形成結晶，沉積后引起一系列臨床癥狀。近年來，隨著痛風發病率的逐年增多，對痛風的研究日益受到重視。

尿酸是天然抗氧化劑的代表。施心猷等［2］研究證實其保護臟器、血管內皮細胞DNA，延緩器官老化，根本原因是它可以清除氧自由基。同時可以延遲淋巴細胞的凋亡，增強機體免疫力。楊春生等［3］在臨床工作中還發現高尿酸血癥與慢性疾病有關，例如高血壓、冠心病等。所以對高尿酸血癥的研究臨床綜合治療和研究各種醫學現象有重要意義。痛風是由于尿酸代謝失衡的結果，如尿酸產生過多和／或排泄減少，使血尿酸在血液中蓄積，就會引發痛風的相關癥狀。由于體內存在尿酸酶，所以人類與SPF雞在尿酸代謝方面存在著顯著差異。因此只有消除這種差異才能達到動物模型與人類痛風相似的目的，目前主要的方法是破壞胚胎干細胞的尿酸酶基因，從而引發痛風，但是由于這種方法使動物腎臟損害非常嚴重，因此死亡率高，此外，這種方法操作復雜，技術要求高，限制了其應用和發展。因此應用尿酸酶的方法建立痛風模型成為主要方法，但依然與人類疾病有著重要差別。

動物模型的建立是尋求新型治療藥物和探究疾病機理的有效途徑，而建立可靠的高尿酸血癥動物模型是研究痛風及其相關疾病發病、新型治療方法的基礎［4］。因此對于痛風的研究也應建立在動物模型的基礎之上，它是尋找新型治療方案的基礎。動物模型設計［5］應首先遵循可靠、適用、相似、再現、可控及易行性等原則，而評價則從模型癥狀、表現、病理變化、反證治療以及模型穩定性等方面進行。周小舟等［6］研究發現人類缺乏尿酸酶基因，從而導致體內缺乏尿酸酶，而大多數動物包括哺乳類動物體內普遍存在尿酸酶，能將尿酸進一步分解為尿囊素，尿囊素無毒、水溶性良好，極易隨尿排出體外，所以血尿酸水平較低。尿酸是人類嘌呤核苷酸代謝終產物，如果嘌呤代謝發生障礙往往會伴隨血尿酸水平升高。國內外大量研究［7］證實，人類和禽類嘌呤核苷酸的代謝途徑極其相似，其終產物尿酸的合成和代謝方面與有共同之處 （核酸在降解過程中也能產生嘌呤類化合物，最終生成血尿酸），所以伴隨飲食中蛋白質和核蛋白增加時，體內尿酸的生成隨之增加。在動物選擇方面，除了種屬之外，還包括性別以及年齡。國內學者何力群實驗證明雌雄動物無明顯差異［8］，但是在實際操作中，一般選用雄性動物，因為同性動物之間，血尿酸正常值差異較大，雌鼠尤為明顯，這可能與雌性動物激素分泌波動有關。為消除年齡因素，在實驗中通常選用機體各項機能正常的年輕動物。SPF雞飼養方便，是常用的實驗用動物。

我們將一定濃度的尿酸鈉液注入關節腔造成急性痛風性關節炎模型，其局部表現、關節液檢查和病理與人類疾病極為相似。在1961年，有研究證實MSU晶體存在于痛風患者關節內，并把尿酸鈉晶體注入狗的關節后成功的誘發急性關節炎，標志著痛風研究史上的里程碑［9］。MSU誘發的急性突發性關節炎是國際上常用的GA模型［10］。尿酸在體液中的溶解度很低 （尿酸最高溶解度是0.385mmol／L），在它飽和后會形成結晶，結晶以尿酸鹽的形式沉積于正常含有大量粘多糖的結締組織中，如關節軟骨內、滑膜內和其他組織，由于這些組織中血管存在較少，組織液pH比較低，便于尿酸鹽沉積。實驗證實雞膝關節腔內注入配置好的MSU液后，關節炎癥狀迅速出現［11］。藥物注射后4h后關節炎已經有明顯表現，關節腔積液和關節周圍組織含有大量的炎癥細胞浸潤。實驗表明，注射后4h與注射后12、24、48h雞膝關節皮膚溫度差異顯著。其關節腫脹與跛行步態可在48h內自行輕微緩解。為達實驗目的，使其更符合人類痛風性關節炎的特性，故反復注射。

通過實驗可觀察到模型組用藥后雞單側的膝關節膚溫升高，局部紅腫較明顯，關節液質濁、量多、色淺微黃，關節周徑增大，食量減少，伴隨明顯的跳躍步態。病理組織改變明顯，光學顯微鏡下可見尿酸鈉晶體沉積于關節及其周圍，血液分析可見白細胞明顯增多，與對照組相比，有統計學意義（P＜0.05），說明尿酸鈉誘導的急性痛風性關節炎模型造模成功。本實驗通過 （單側膝關節）腔隙注射尿酸鈉溶液，建造出較為成熟穩定的急性痛風性關節炎的動物模型，給痛風性關節炎的研究、尋找新的抗痛風藥物以及抗痛風藥物的作用帶來參考和對照。