血管緊張素Ⅱ2型受體阻滯劑對(duì)小鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響*

李升紅， 萬(wàn) 婷， 劉宏偉△， 程 飚， 肖麗玲， 謝光輝， 盧金強(qiáng)， 肖 靜

(1暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形外科，再生醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510632;2廣州市婦女兒童醫(yī)療中心婦產(chǎn)科，廣東廣州510623;3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院整形外科，廣東廣州510110)

血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，Ang II)是腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)最重要的活性產(chǎn)物，在應(yīng)激情況下調(diào)控血壓和水電解質(zhì)平衡，而且在創(chuàng)傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用［1-4］。Ang II 1型受體(angiotensin II type 1 receptor，AT1受體)介導(dǎo)了Ang II的大部分病理生理作用，大量的研究資料證實(shí)AngII與其AT1受體結(jié)合后具有促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、遷移及促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)的作用［5-8］。近來(lái)有研究證實(shí)AT1受體阻斷劑具有抑制創(chuàng)面內(nèi)上皮化、肉芽組織形成和抑制創(chuàng)面內(nèi)局部生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，延緩創(chuàng)面愈合的作用［9-10］。

然而Ang II及其2型受體(AT2受體)在創(chuàng)面如何發(fā)揮作用尚不清楚。為進(jìn)一步闡明AT2受體在Ang II調(diào)控創(chuàng)面修復(fù)中的作用及其機(jī)制，我們通過(guò)建立小鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面模型，觀察阻斷AT2受體后對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程及其對(duì)創(chuàng)面局部生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響，探討AngⅡ和AT2受體調(diào)控皮膚損傷修復(fù)的作用及其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 材料

小鼠表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)定量酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自RB。HE染色試劑購(gòu)自廣州化學(xué)試劑公司。

2 動(dòng)物分組及方法

2.1 小鼠創(chuàng)面模型的建立 健康SPF級(jí)近交系雄性C57BL/6J小鼠42只，8～10周齡，體重25～30 g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào)為SCXK粵2006-0015)。采用隨機(jī)數(shù)字表法根據(jù)檢測(cè)需要隨機(jī)分成對(duì)照組和PD123319處理組，每個(gè)時(shí)點(diǎn)3只小鼠，每實(shí)驗(yàn)組21只小鼠。在小鼠背部距離中線5 mm兩側(cè)各制作1個(gè)直徑為6 mm的圓形全層皮膚缺損創(chuàng)面。創(chuàng)面形成后，對(duì)照組小鼠每天腹腔注射生理鹽水0.1 mL，PD123319處理組小鼠每天腹腔注射濃度為1.25 g/L的PD123319溶液0.1 mL(1.25 mg PD123319溶于1 mL生理鹽水，每天10 mg/kg)［11-13］。創(chuàng)面形成后第 3、5、7、9、11、13、15 天切取包括2 mm正常組織的創(chuàng)面組織標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本均分為2份，分別用液氮保存及10%中性甲醛固定。

2.2 創(chuàng)面愈合率的計(jì)算 小鼠處死前，以0.08 mL 10%水合氯醛麻醉小鼠，創(chuàng)面附近加標(biāo)準(zhǔn)比例尺，在距離創(chuàng)面10 cm的上方用數(shù)碼相機(jī)(Sony，1 010萬(wàn)像素)拍照。以ImageJ圖像分析軟件結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)比例尺分別計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組小鼠各時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面面積占原始面積大小，作為各時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面愈合的百分率。計(jì)算公式如下:創(chuàng)面愈合率(%)=(1-各時(shí)點(diǎn)創(chuàng)面面積/原始創(chuàng)面面積)×100%。

2.3 創(chuàng)面愈合過(guò)程中上皮爬行距離的計(jì)算 10%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋切片，HE染色，染色切片在Leica核型分析顯微鏡5 010倍下觀察創(chuàng)面愈合過(guò)程中上皮爬行距離并拍照，按比例尺計(jì)算創(chuàng)面上皮爬行距離(mm)。

2.4 創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織面積計(jì)算 10%甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋切片，HE染色，顯微鏡下觀察肉芽組織形成情況，連續(xù)采集50倍照片并拼圖。以ImageJ圖像分析軟件結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)尺分別計(jì)算出各實(shí)驗(yàn)組小鼠各時(shí)點(diǎn)肉芽組織的面積(mm2)。

2.5 創(chuàng)面EGF、VEGF和bFGF含量的測(cè)定 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，將保存在液氮中的新鮮組織標(biāo)本各取0.2 g，電動(dòng)勻漿機(jī)研磨，4℃、15 000 r/min離心30 min(離心半徑為6 cm)，取上清與PBS液溶解測(cè)定EGF、VEGF和bFGF的蛋白濃度。用抗鼠EGF、VEGF和bFGF單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的鼠EGF、VEGF和bFGF與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗鼠EGF、VEGF和bFGF抗體，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加入硫酸終止液，在450 nm處測(cè)吸光度(A)值，每個(gè)樣本重復(fù)3次，小鼠EGF、VEGF和bFGF濃度與A值呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各時(shí)點(diǎn)小鼠創(chuàng)面標(biāo)本中EGF、VEGF和bFGF的濃度，將上述求出的濃度計(jì)算時(shí)乘以總稀釋倍數(shù)(樣本稀釋倍數(shù))，再除以0.2 g/1.5 mL(樣品量與生長(zhǎng)因子提取液之比)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PD123319對(duì)創(chuàng)面愈合率的影響

對(duì)照組小鼠背部直徑6 mm全層皮膚缺損創(chuàng)面在傷后第3天面積縮小至(30.62±4.96)%，在傷后第5天愈合率明顯加快，愈合率約為(63.55±2.57)%，第7天愈合率為(80.78±4.65)%，第9天愈合率為(93.19±6.72)%。PD123319處理組小鼠創(chuàng)面在傷后第3天面積縮小至(32.88±5.17)%，在傷后第5天、第7天與對(duì)照組差別較大，愈合率分別為(79.89±4.56)%和(88.98±3.83)%，第9天的愈合率為 (95.68±3.65)%，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Effect of PD123319 on the rates of wound healing.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖1 PD123319對(duì)創(chuàng)面愈合率的影響

2 PD123319對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中上皮爬行距離的影響

上皮化是創(chuàng)面愈合的重要標(biāo)志。在創(chuàng)面形成后第3天出現(xiàn)明顯的上皮爬行現(xiàn)象。在傷后第3天對(duì)照組上皮爬行距離為(0.25±0.08)mm，PD123319處理組上皮爬行距離為(0.27±0.11)mm，在傷后第5天對(duì)照組的上皮爬行距離為(1.22±0.15)mm，PD123319處理組在創(chuàng)面形成第5天上皮爬行距離為(1.65±0.12)mm。在傷后第7天對(duì)照組上皮爬行距離為(1.93±0.17)mm，PD123319處理組上皮爬行距離為(2.36±0.18)mm，見(jiàn)圖2。

3 PD123319對(duì)創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織形成的影響

創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織是由新生的成纖維細(xì)胞和毛細(xì)血管組成，對(duì)創(chuàng)面愈合起著重要的作用。小鼠背部6 mm圓形創(chuàng)面在第3天后形成肉芽組織，對(duì)照組第3天肉芽組織面積為(11.96±1.12)mm2，第5天面積為(9.37±0.53)mm2，第7天面積為(7.15±0.42)mm2;PD123319處理組第3天面積為(12.17±1.73)mm2，第5天面積為(11.51±0.98)mm2，第 7天面積為(9.32±0.67)mm2，PD123319處理組小鼠肉芽組織面積明顯低于對(duì)照組小鼠，見(jiàn)圖3。

4 PD123319對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中 EGF、VEGF和bFGF產(chǎn)生的影響

因PD123319對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中創(chuàng)面愈合率、肉芽組織形成和上皮爬行距離的影響在傷后第5和7天表現(xiàn)出最為明顯的效應(yīng)，因而于創(chuàng)面形成后第5和7天檢測(cè)創(chuàng)面新鮮肉芽組織中EGF、VEGF和bFGF表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD123319組小鼠創(chuàng)面肉芽組織中的生長(zhǎng)因子表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2.Effect of PD123319 on migration distance of the epithelium(HE staining，×50).Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group.圖2 PD123319對(duì)創(chuàng)面愈合過(guò)程中上皮化的影響

Figure 3.Effect of PD123319 on granulation tissue area(HE staining，×50).Mean±SD.n=6.*P ＜0.05 vs control group.圖3 PD123319對(duì)創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織形成的影響

討 論

AngⅡ是RAS最重要的生物活性肽，除經(jīng)典作用外還作為一個(gè)多效應(yīng)生長(zhǎng)因子可影響細(xì)胞的增殖、凋亡和分化，參與皮膚組織的胚胎發(fā)育、自我更新和損傷修復(fù)［3］。目前已經(jīng)明確的血管緊張素受體主要是AT1和AT2受體［14］。血管緊張素受體阻滯劑是新一類抗高血壓藥物，其作用機(jī)制為競(jìng)爭(zhēng)性拮抗AT1或AT2受體，能夠完全阻斷Ang II通過(guò)AT1或AT2發(fā)揮其生理作用。目前普遍認(rèn)為AngⅡ主要的病理生理學(xué)作用由AT1受體介導(dǎo)［6］，其與 AngⅡ結(jié)合在外周組織可以刺激生長(zhǎng)因子合成，促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移及促進(jìn)創(chuàng)面細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成。AT2受體的作用可能與AT1受體相反，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境中，AT2受體激活后可發(fā)揮抑制增殖、舒張血管、促進(jìn)凋亡等作用［15］。Munk 等［16］發(fā)現(xiàn)在小鼠缺血心肌模型中AngⅡ通過(guò)AT2受體可以誘導(dǎo)血管形成。Waseda等［17］在小鼠肺纖維化動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)AngⅡ與AT2受體結(jié)合可以減輕博來(lái)霉素導(dǎo)致的纖維化。Izu等［18］發(fā)現(xiàn) AT2阻滯劑能夠促進(jìn)骨質(zhì)形成。吳姮君等［4］發(fā)現(xiàn)在小鼠皮膚組織中有AT2受體的表達(dá)，AT2受體在創(chuàng)面形成后逐漸升高，在創(chuàng)面愈合后即開(kāi)始下降，當(dāng)創(chuàng)面愈合后再次逐漸升高，AT2受體可能與創(chuàng)面內(nèi)細(xì)胞凋亡及其創(chuàng)面愈合后的重建塑型有關(guān)。

然而AT2受體在皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的作用卻知之甚少。為探明AngⅡ及其AT2受體在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用，我們通過(guò)給予AT2受體特異性阻斷劑PD123319，觀察其對(duì)創(chuàng)面愈合的影響。在本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到PD123319加快了小鼠創(chuàng)面愈合的速度，創(chuàng)面內(nèi)上皮爬行和肉芽組織形成都表現(xiàn)出明顯加快的現(xiàn)象。因此推測(cè)AT2受體阻滯劑能夠促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)上皮細(xì)胞遷移和肉芽組織形成，具有促進(jìn)創(chuàng)傷愈合的作用。

此外，使用AT2受體特異性阻斷劑后，在創(chuàng)面形成后第5天和第7天創(chuàng)面組織內(nèi)EGF、VEGF和bFGF的含量明顯高于對(duì)照組小鼠。因此推測(cè)AT2受體阻斷劑促進(jìn)創(chuàng)面上皮化和肉芽組織形成可能與促進(jìn)創(chuàng)面局部生長(zhǎng)因子的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，阻滯AT2受體可以促進(jìn)創(chuàng)面上皮細(xì)胞遷移和肉芽組織形成，其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用可能與其促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)EGF、VEGF和bFGF等生長(zhǎng)因子的表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果將有可能為難愈創(chuàng)面和瘢痕的治療提供新的思路和方法。