川芎嗪與氨基胍聯合治療對新生鏈脲佐菌素糖尿病大鼠肝功能的影響*

宋春紅， 李 莉， 張永歡， 王蔚琛， 竇橙云， 李瑞峰△

(1石家莊市第四醫院病理科，河北石家莊050011;2山東大學醫學院病理生理學研究所，山東濟南250012;3青島市城陽區人民醫院病理科，山東青島266100;4濱州醫學院病理生理學教研室，山東煙臺264003;5山東大學齊魯醫院肝病科，山東 濟南250012)

肝臟是人體最大的能量代謝器官及胰島素敏感組織。糖尿病是復雜的系統性疾病，以代謝紊亂為顯著特征，可以引起肝臟組織學、分子生物學及功能改變。川芎嗪(tetramethylpyrazine，TMP)是中藥川芎中的一種生物堿，具有降血糖、活血化瘀、擴張血管、抗凋亡、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等多種作用［1-2］。氨基胍(aminoguanidine，AG)為一種親核類的肼類化合物，通過抑制晚期糖基化終末產物(advanced glycosylation end products，AGEs)的形成和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活性而被公認為干預糖尿病有效的藥物。本課題組前期研究顯示，聯合應用川芎嗪及氨基胍，無論在降低新生鏈脲佐菌素糖尿病大鼠(neonatal-0 streptozocininduced rats，n0-STZ大鼠)空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、空腹胰島素(fasting insulin，FINS)和胰島素抵抗指數(insulin resistance index，IRI)方面，還是在降低血漿NO、糖化血紅蛋白水平及外周血白細胞iNOS表達方面，均比單用川芎嗪或氨基胍治療效果顯著［3］;且聯合治療可以通過抑制硝化應激而改善n0-STZ大鼠腎臟功能［4］。本研究擬進一步觀察川芎嗪與氨基胍聯合應用對n0-STZ大鼠肝臟損害的保護效果與機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 出生當日的Wistar大鼠100只，體重約6 g，山東大學實驗動物中心提供。動物先由母乳喂養，于4周齡后雌雄分籠喂養，自由攝水攝食。室內溫度控制在(22±3)℃，維持12/12 h的白天/黑夜交替。

1.2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自Sigma;氨基胍鹽酸鹽購自上海達瑞精細化學品有限公司;鹽酸川芎嗪購自天津藥業集團新鄭股份有限公司;鹽酸二甲雙胍(metformin，MET)購自北京京豐制藥有限公司;兔抗大鼠caspase-3、Fas及 Bcl-2Ⅰ抗購自武漢博士德公司;兔抗大鼠iNOSⅠ抗由北京博奧森生物技術有限公司提供;小鼠抗大鼠β-actin抗體、辣根酶標記山羊抗兔IgGⅡ抗及山羊抗小鼠IgGⅡ抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司;NO和iNOS測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司;ECL化學發光增強顯色試劑盒購自Millipore。

2 方法

2.1 n0-STZ大鼠模型制備及分組 出生當日的Wistar大鼠100只，隨機選取80只左下腹消毒，腹腔注射STZ 90 mg/kg，STZ臨用前溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，經微孔濾膜過濾除菌。其余20只作為正常對照(normal control，NC)組，腹腔注射生理鹽水。正常飼養至8周齡，空腹血糖≥7.0 mmol/L者選入本研究。將胰島素抵抗大鼠隨機分為模型(nodel，MD)組、MET治療組和TMP+AG聯合治療組，每組20只。MET組每天經飲水攝入二甲雙胍125 mg/kg;TMP+AG組每天經飲水攝入鹽酸川芎嗪50 mg/kg與氨基胍鹽酸鹽25 mg/kg。喂養24周，觀察大鼠一般情況。

2.2 血液生化檢查 32周齡，全部大鼠摘取眼球采血處死，留取血清、血漿。檢測FPG和FINS，IRI根據公式IRI=(FPG×FINS)/22.5計算。酶學法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartateamino transferase，AST)水平。

2.3 iNOS活性和NO濃度檢測 10%肝組織勻漿，依次加入試劑充分混勻，490 nm(NO)或530 nm(iNOS)波長測各管吸光度值。

2.4 HE染色 取肝臟組織，4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，制作5μm石蠟切片，進行HE染色，在顯微鏡下觀察組織的病理形態學變化。

2.5 Western blotting檢測肝臟組織中 iNOS、Fas、Bcl-2和caspase-3蛋白的表達 取組織50 mg，加入細胞裂解液，經機械和超聲勻漿，4℃低溫12 000 r/min(離心半徑10 cm)離心10 min，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測總蛋白質濃度，將各組濃度調到同一水平，制備10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離蛋白，將蛋白質轉到硝酸纖維素濾膜上，5%脫脂奶粉TBST緩沖液室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，加入Ⅰ抗4℃過夜，TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次。通過ECL化學發光增強顯色試劑盒進行顯色，MF-ChemiBIS儀器成像系統成像，蛋白峰面積灰度分析，以β-actin為內參照進行蛋白半定量分析。

3 統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件分析。數據用均數±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。采用Kaplan-Meier法估計生存率，生存率假設檢驗采用log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 n0-STZ大鼠成模情況

8周齡時，80只大鼠中有 66只 FPG≥7.0 mmol/L，成模率為82.5%，死亡率為0。該組大鼠尿量增多，體重增加，皮毛色黃、缺少光澤，活動量少。

2 各組大鼠生存率比較

32周齡時，NC組存活20只，存活率100%;MD組存活7只，存活率35%;MET組存活14只，存活率70%;TMP+AG組存活17只，存活率85%。MD組和MET組生存率明顯低于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組生存率明顯高于MD組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組組間生存率無顯著差異。

3 各組大鼠FPG、FINS和IRI檢測結果

32周齡時MD組的FPG明顯高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組較MD組顯著下降(P＜0.05)，兩干預組及NC組之間無顯著差異;MD組FINS高于NC組(P＜0.05)，TMP+AG組低于MD組(P＜0.05)，也低于 MET組(P＜0.05)，但高于NC組(P＜0.05)，MET組與MD組之間無顯著差異;對于IRI，MD組明顯高于NC組(P＜0.05)，MET組和TMP+AG組低于MD組(P＜0.05)，TMP+AG組低于MET組(P＜0.05)，見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖、空腹胰島素和胰島素抵抗指數的觀察Table 1.The levels of FPG，FINSand IRI in the rats(Mean±SD)

4 各組大鼠肝功能檢測結果

32周齡時，MD組的血清ALT和AST水平較NC組明顯增加(P＜0.01)，與MET組相比，聯合治療在降低ALT(P＜0.01)和AST(P＜0.01)水平方面作用較強，見表2。

表2 各組大鼠血清ALT與AST水平的變化Table 2.The serum levels of ALT and AST in the rats(U/L.Mean±SD)

表3 各組大鼠肝的NO濃度及iNOS活性Table 3.NO concentrations and iNOSactivities of the rat livers(Mean±SD)

5 HE染色結果

NC組肝小葉結構完整，輪廓清晰，肝小葉肝細胞分界清晰，胞核圓，位于細胞中央，偶見雙核，胞質豐富。MD組肝索排列紊亂，肝細胞出現脂肪變性，匯管區炎細胞浸潤，肝細胞出現多灶小灶性壞死，表現為核固縮或破碎，與周圍細胞連接松散。二甲雙胍及聯合治療可以改善糖尿病引起的肝臟病理變化，見圖1。

6 各組大鼠肝臟NO濃度和iNOS活性變化

32周齡時，MD組肝臟的NO濃度和iNOS活性較NC組明顯增加(P＜0.01)，與MET組相比，聯合治療在降低NO濃度(P＜0.01)和iNOS活性(P＜0.05)方面作用較強，見表3。

Figure 1.HE staining of the rat livers(×100).A:normal control group;B:model group;C:metformin treatment group;D:tetramethylpyrazine+aminoguanidine treatment group.圖1 各組肝臟組織HE染色

7 各組肝組織Western blotting結果

iNOS在NC組肝臟組織中表達較少，在MD組中表達明顯增多(P＜0.01)，二甲雙胍和聯合治療均可降低iNOS的表達，且以TMP+AG組降低更為顯著(P ＜0.01)，見圖2。

Bcl-2在MD組表達較NC組明顯下降(P＜0.01)，MET組和TMP+AG組Bcl-2表達增加(P＜0.01)，干預組之間無顯著差異，見圖2。

Figure 2.The expression of Bcl-2 and iNOSin the rat livers.βactin served as internal control.NC:normal control group;MD:model group;MET:metformin treatment group;TMP+AG:tetramethylpyrazine+aminoguanidine treatment group.Mean±SD.＊＊P ＜0.01 vs normal control group;▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs model group;##P＜0.01 vs metformin treatment group.圖2 各組肝組織Bcl-2和iNOS的表達結果

Caspase-3在NC組肝臟組織中表達較少，在MD組中表達明顯增多(P＜0.01)，二甲雙胍和聯合治療均可降低caspase-3的表達，且以TMP+AG組降低更為顯著(P＜0.01)，見圖3。

Fas在 MD組表達較 NC組明顯升高(P＜0.01)，聯合治療可顯著降低Fas表達(P＜0.01)，而二甲雙胍治療對Fas表達無明顯作用，見圖3。

Figure 3.The expression of activated caspase-3 and Fas in the rat livers.β-actin served as internal control.NC:normal control group;MD:model group;MET:metformin treatment group;TMP+AG:tetramethylpyrazine+aminoguanidine treatment group.Mean±SD. ＊＊P＜0.01 vs normal control group;▲P＜ 0.05，▲▲P＜0.01 vs model group;##P＜0.01 vs metformin treatment group.圖3 各組肝組織活化型caspase-3和Fas的表達結果

討 論

本實驗研究結果顯示，n0-STZ糖尿病大鼠肝損傷的標志物ALT和AST升高，肝臟病理學發生改變。與此相對應，肝臟iNOS表達水平升高、活性增強且NO水平升高，凋亡相關蛋白Fas和caspase-3表達水平升高，抑制凋亡的蛋白Bcl-2表達下降。川芎嗪與氨基胍聯合治療可以降低血清ALT和AST水平，減輕糖尿病所致肝損傷，結合本實驗結果及參考文獻，主要機制可能涉及以下三方面:

(1)聯合治療可以降低血糖水平。高血糖通過促進活性氧簇和AGES生成，促進肝細胞損傷的發生。血糖升高的主要原因是胰島素抵抗和/或胰島β細胞功能受損。氨基胍通過特異性抑制iNOS活性、iNOS表達及AGEs形成而改善胰島 β細胞功能［5-6］。川芎嗪本身具有降血糖作用［7］，與氨基胍聯合治療可以發揮協同作用，通過增加胰島β細胞免疫陽性染色的面積及細胞數量而發揮對胰島β細胞的保護作用［8］。本實驗研究結果亦表明，聯合治療可以降低胰島素抵抗指數，從而增強外周組織的胰島素敏感性而發揮降血糖作用。

(2)聯合治療可以特異性抑制肝臟iNOS活性，抑制iNOS蛋白表達，減少NO生成而發揮對肝細胞的保護作用。作為一種自由基，iNOS源性NO可以與活性氧類中間產物反應生成過氧亞硝酸鹽陰離子等活性氮和(或)活性氧類物質。在機體抗氧化能力減弱的情況下，NO可直接或通過這些活性產物與蛋白、核酸等大分子起反應，調控細胞功能，造成組織、細胞損傷［9-10］。氨基胍屬于精氨酸類似物，能選擇性地抑制iNOS活性，另外，氨基胍可通過降低核因子-κB p65及iNOS表達，緩解硝酸鹽應激而對糖尿病肝損傷發揮保護作用［11］。川芎嗪在小膠質細胞N9細胞中通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶、胞外信號調節激酶1/2、c-Jun氨基末端激酶及蛋白激酶B磷酸化，抑制核因子-κB從胞漿向胞核轉位而抑制脂多糖誘導的iNOS表達和NO生成［12］。在肝細胞中是否以類似機制抑制iNOS表達和NO生成還有待深入研究。

(3)聯合治療可以增加肝臟抗凋亡蛋白的表達、降低促凋亡蛋白表達，從而緩解肝細胞凋亡發揮對肝組織的保護作用。介導細胞凋亡的途徑主要有死亡受體通路、線粒體通路及內質網通路等。Caspase是諸多調控通路的關鍵，而caspase-3又處于caspase級聯反應的中心地位，caspase-3的激活是細胞凋亡的早期事件和特異性分子標記之一。Fas蛋白屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，通過Fas配體-Fas-Fas死亡結構域相關蛋白-caspase-8-caspase-3效應分子的信號轉導級聯反應而發揮促細胞凋亡作用。線粒體通路主要由Bcl-2家族成員介導。Bcl-2可抑制線粒體膜通透性轉變孔的開放，減少細胞色素C及凋亡因子的釋放，促使氫離子從線粒體中泵出，并提高線粒體的鈣緩沖能力而發揮抗細胞凋亡的功能。聯合治療可以通過降低 Fas、活化型caspase-3表達、促進Bcl-2表達而減少糖尿病所致肝細胞凋亡。

二甲雙胍是臨床上應用廣泛的治療糖尿病的藥物。與二甲雙胍相比，聯合治療在降低糖尿病大鼠FINS、增強胰島素敏感指數、抑制iNOS活性、iNOS蛋白表達、降低Fas及活化型caspase-3表達等方面優于二甲雙胍，為糖尿病發病機制的研究及尋找新的治療方案提供了新的選擇。