黑木耳粗提物在大鼠急性腎功能衰竭過程中的作用*

馬小娟， 馬 琪， 于文燕△， 孫 湛， 劉熠雯， 王燕杰， 郭 文， 王 珍

(新疆醫(yī)科大學(xué)1病理生理學(xué)教研室，2機(jī)能中心，3臨床醫(yī)學(xué)系，新疆 烏魯木齊830011)

急性腎功能衰竭(acute renal failure，ARF)是一種常見的臨床危重癥，盡管醫(yī)療水平有了較大的提高，死亡率仍然居高不下。目前認(rèn)為，腎小球?yàn)V過率(glomerular filtration rate，GFR)的急劇降低是 ARF發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前臨床多采用對(duì)癥治療。尿毒清是一純中藥制劑，主要由大黃、黃芪、丹參、川芍、黨參、車前草、甘草等物質(zhì)組成，具有降低血肌酐、尿素氮及減少尿蛋白等功效，因此可在一定程度上穩(wěn)定腎臟功能，延緩?fù)肝鰰r(shí)間。但部分病人服用后易產(chǎn)生嚴(yán)重的腹瀉，從而使機(jī)體發(fā)生水電解質(zhì)代謝紊亂，加重病情。既往的研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳可通過抗氧化作用減輕大鼠慢性腦缺血損傷［1］，本課題組的研究也表明，在感染性休克和膿毒血癥時(shí)，黑木耳可通過降低血清中內(nèi)毒素、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)及白細(xì)胞介素 1(interleukin 1，IL-1)的含量，而對(duì)重要臟器發(fā)揮保護(hù)作用［2］。黑木耳在ARF的發(fā)病過程中是否也具有保護(hù)作用，目前尚無相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過觀察黑木耳粗提物在大鼠腹腔注射順鉑誘發(fā)急性腎功能衰竭中的作用，探討其可能的機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1．1 動(dòng)物 選取清潔級(jí)健康Wistar雄性大鼠32只(由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，體重200～250 g。

1．2 主要試劑及儀器 尿毒清顆粒(內(nèi)蒙古康臣藥業(yè)有限責(zé)任公司)，順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)，東北黑木耳(產(chǎn)地山東煙臺(tái))，Cobasb121血?dú)夂碗娊赓|(zhì)分析儀、尿素氮和肌酐測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)，實(shí)驗(yàn)用引物由生工上海生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2 動(dòng)物及分組

32只Wistar大鼠隨機(jī)分為:(1)對(duì)照組:1次腹腔注射(ip)與順鉑等容積生理鹽水(NS);(2)模型組:1次ip順鉑6 mg/kg;(3)黑木耳組:1次ip順鉑6 mg/kg+灌胃注入黑木耳粗提液(15 mL/kg);(4)尿毒清組:1次ip順鉑6 mg/kg+灌胃注入尿毒清溶液(3 g·kg－1·d－1)。每組8 只。

3 方法

各組大鼠分別腹腔注射等容積的生理鹽水和順鉑，治療組分別經(jīng)胃灌注黑木耳粗提物和尿毒清。1周后從頸動(dòng)脈采血測(cè)定指標(biāo)，處死動(dòng)物。取右腎組織快速置于液氮中，左腎組織固定于10%甲醛中，常規(guī)石蠟包埋。

4 檢測(cè)指標(biāo)

4．1 血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatine，Cr)的測(cè)定 從頸動(dòng)脈采血2 mL后離心15 min(3 500 r/min)取上清，后按照試劑盒操作說明書測(cè)定BUN及Cr。

4．2 血?dú)夥治?各組大鼠從頸動(dòng)脈采血，采用Cobasb121儀器即刻測(cè)定血?dú)猓ㄑ狵+濃度、pH值、氧分壓(partial pressure of oxygen，PO2)、二氧化碳分壓(partial pressure of carbon dioxide，PCO2)、氧飽和度(oxygen saturation，SO2)、緩沖堿(buffer base，BB)和陰離子間隙(aninon gap，AG)。

4．3 RT-PCR檢測(cè)各組大鼠腎組織內(nèi)皮素1(endothelin-1，ET-1)mRNA的表達(dá)水平 用Trizol法提取各組大鼠腎組織總RNA，后使用。試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)定各組ET-1與β-actin的灰度值并進(jìn)行半定量分析。ET-1上游引物5'-atacacaaccgagcacattgac-3'，下游引物5'-tcagacacgaacactccctaag-3'，PCR產(chǎn)物為401 bp，退火溫度為 55℃。β-actin上游引物5'-acccccactgaaaaagatga-3'，下 游 引 物 5'-atcttcaaacctccatgatg-3'，PCR產(chǎn)物為120 bp，退火溫度為57℃。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，采用方差分析和t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 BUN和Cr的變化

模型組、黑木耳組和尿毒清組與對(duì)照組比較，BUN和Cr含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，黑木耳組中BUN和Cr的含量均低于模型組(P＜0.05)，見表 1。

表1 各組大鼠BUN和Cr含量的變化Table 1．Changes of BUN and Cr in every group(Mean±SD．n=8)

2 各組大鼠腎組織ET-1 mRNA表達(dá)水平

模型組與尿毒清組中ET-1 mRNA的表達(dá)高于對(duì)照組和黑木耳組(P＜0.05)，而黑木耳組與對(duì)照組比較，ET-1 mRNA的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見圖1。

3 血?dú)夥治?/h3>

pH值:模型組、尿毒清組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而黑木耳組的pH值與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PO2:模型組、黑木耳組和尿毒清組PO2高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);PCO2:模型組的PCO2高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但黑木耳組與尿毒清組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);SO2:模型組、尿毒清組SO2低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但黑木耳組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，尿毒清組SO2低于黑木耳組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);BB:模型組、黑木耳組和尿毒清組均低于對(duì)照組(P＜0.05)，且黑木耳組高于模型組和尿毒清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);AG:模型組、黑木耳組和尿毒清組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且尿毒清組高于黑木耳組(P＞0.05);血K+濃度:模型組和尿毒清組血K+濃度高于對(duì)照組和黑木耳組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表 2。

Figure 1．The expression of ET-1 mRNA in renal tissues in different groups．Mean ± SD．n=8．▲ P ＜ 0.05 vs control group;☆P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs black fungus group．圖1 各組腎組織中ET-1 mRNA的表達(dá)

表2 各組大鼠血?dú)庵笜?biāo)的變化Table 2．Changes of the blood gas in every group(Mean±SD．n=8)

Figure 2．The pathological changes of renal tissues in different groups(HE staining，×400)．A:control group;B:model group;C:black fungus group;D:niaoduqing group．圖2 各組腎組織病理學(xué)改變

4 各組大鼠腎組織病理學(xué)改變

正常組腎小球毛細(xì)血管未見擴(kuò)張、充血，腎小管未見擴(kuò)張，間質(zhì)無出血;模型組可見腎小球毛細(xì)血管呈中、重度擴(kuò)張充血，部分腎小管間質(zhì)出血;黑木耳組中僅見腎小管擴(kuò)張及間質(zhì)血管的擴(kuò)張充血;尿毒清組中腎小球毛細(xì)血管中度擴(kuò)張充血，部分腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮輕度水腫，見圖2。

討 論

ARF是指各種原因在短期內(nèi)(通常數(shù)小時(shí)至數(shù)天)，引起腎臟泌尿功能急劇障礙，以致機(jī)體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)嚴(yán)重紊亂的病理過程。而內(nèi)環(huán)境的紊亂又可加重原有的病情［3］。腎臟除具有泌尿功能外，還具有內(nèi)分泌功能，可合成與分泌ET-1。ET通過自分泌與旁分泌的方式調(diào)節(jié)腎臟的功能，被認(rèn)為是進(jìn)行性腎損傷的調(diào)節(jié)因子［4］。

本研究顯示，模型組腎組織ET-1 mRNA表達(dá)為0．89±0．06，且BUN和Cr的含量均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，可能是由于順鉑導(dǎo)致了腎血管的收縮，使腎血流量及GFR降低所致［5］。而腎損傷時(shí)腎內(nèi)血流重分布又將影響腎血流動(dòng)力學(xué)，促使內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌更多的ET-1，即通過正反饋調(diào)節(jié)加速了腎小球的損傷。

尿毒清是臨床上常用的腸道吸附劑，具有通腑降濁、健脾利濕、活血化瘀等功效，但對(duì)腎小球的作用不明顯［6］。本實(shí)驗(yàn)通過使用尿毒清灌胃后發(fā)現(xiàn)，尿毒清組ET-1 mRNA的表達(dá)、BUN和Cr的含量均低于模型組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而黑木耳隸屬于真菌門，其中含大量由多糖及蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的木耳凝膠，對(duì)人體有重要的生理功能。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤、降血脂和抗炎等功能。本實(shí)驗(yàn)黑木耳組中ET-1 mRNA的表達(dá)明顯減少，BUN和Cr的含量也低于模型組。故考慮黑木耳可能通過減少血管活性物質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)局部血管的張力，從而改善腎血流量及腎小球的濾過功能，減少了代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的堆積。

AFR少尿期機(jī)體發(fā)生“一少四多”(少尿、水中毒、高鉀血癥、代謝性酸中毒和氮質(zhì)血癥)，其中高鉀血癥是最危險(xiǎn)的改變，而其與代謝性酸中毒又互為因果［3］。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察了各組血?dú)庵笜?biāo)的改變后發(fā)現(xiàn)，模型組的pH值、PCO2和BB與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);尿毒清組的pH值、BB與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但PCO2與對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)，提示模型組和尿毒清組均發(fā)生了失代償性的呼吸性堿中毒合并代謝性酸中毒。同時(shí)兩組血清K+濃度均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。黑木耳組中pH值、PCO2與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而BB低于對(duì)照組(P＜0.05)，提示黑木耳組發(fā)生了代償性的呼吸性堿中毒合并代謝性酸中毒，且血清K+濃度低于模型組和尿毒清組(P＜0.05)。故考慮黑木耳粗提物可能通過維持體內(nèi)電解質(zhì)和酸堿平衡以達(dá)到改善內(nèi)環(huán)境的目的。

綜上所述，黑木耳在急性腎功能衰竭的發(fā)病過程中，具有一定的保護(hù)作用。其機(jī)制可能是影響了血管活性物質(zhì)的合成與釋放，調(diào)節(jié)體內(nèi)電解質(zhì)和酸堿的平衡，最終維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但是黑木耳對(duì)急性腎功能衰竭的腎小管有無作用，仍有待進(jìn)一步研究。