人EGFL7基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其在人喉癌細胞中的表達*

張革化， 常利紅， 葉 進， 莊士民， 王 凱， 黎景佳△

(中山大學附屬第三醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣東廣州510630)

表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域7(epidermal growth factor-like domain 7，EGFL7)是由 Soncin 等［1］于 2003年首先發(fā)現(xiàn)的一個在血管內(nèi)皮細胞特異性表達的基因，其編碼蛋白在新生血管“管腔形成”這一關(guān)鍵步驟中發(fā)揮重要作用［2］。在生理情況下，EGFL7在胚胎期、新生兒期的原始內(nèi)皮細胞、各種血管內(nèi)皮細胞和妊娠期的子宮中呈高表達，而在幾乎所有成年個體的成熟組織中EGFL7均表達下調(diào);某些病理狀態(tài)，如腫瘤、血管損傷及炎癥組織中有大量血管新生的現(xiàn)象，其EGFL7的表達呈明顯上調(diào)［3］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，EGFL7在喉鱗狀細胞癌組織中表達上調(diào)，其表達水平與喉癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后有關(guān)，多變量Cox風險比例模型分析表明EGFL7表達水平是喉癌預后的獨立預測因子，提示EGFL7表達異常與喉癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系［4］。為進一步探討EGFL7表達對喉癌生物學行為的影響，本研究擬構(gòu)建穩(wěn)定干擾人EGFL7基因的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)人喉癌細胞，為研究EGFL7蛋白參與喉癌發(fā)生發(fā)展的作用機制奠定基礎。

材料和方法

1 細胞株

人胚腎上皮293T細胞和感受態(tài)大腸桿菌DH5α由中山大學分子醫(yī)藥生物學實驗室提供，人喉表皮樣癌細胞HEp-2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

2 主要試劑

pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體、pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-negative-control載 體、POLOdelivererTM3000、pLenti6．3-MCS/V5-DEST 系列慢病毒表達載體和慢病毒包裝質(zhì)粒均購自Invitrogen。Polybrene購自Sigma。質(zhì)粒Midi抽提試劑盒購自Qiagen。Blasticidin購自Calbiochem。qPCR SYBR Green Mix購自東盛。DMED培養(yǎng)基、胎牛血清和 Opti-MEM培養(yǎng)基均購自Gibco。

3 主要方法

3．1 人EGFL7基因有效干擾靶點的篩選 參考GenBank數(shù)據(jù)庫人EGFL7 cDNA(NM_016215)序列，利用Invitrogen公司的在線設計軟件(http://rnaidesigner．invitrogen．com/rnaiexpress/)，根據(jù) RNAi設計原則［5］，設計4對EGFL7基因的特異性干擾片段，經(jīng)BLAST分析確認其特異性后，由上海銳賽生物技術(shù)有限公司合成。

將合成的4對寡核苷酸的各2條鏈等量混勻，于95℃作用5 min退火，冷卻至室溫形成雙鏈寡核苷酸(ds Oligo)，將ds Oligo與線性化的pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR RNAi表達載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)壯觀霉素篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒，測序驗證插入序列的正確性，4個候選干擾質(zhì)粒分別命名為pcDNA6．2-GW/EGFL7-1/2/3/4，對照質(zhì)粒為 pcDNA6．2-GW/miR-negative-control。

分別取候選干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，采用POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent轉(zhuǎn)染293T細胞，于轉(zhuǎn)染后48 h熒光顯微鏡下觀察EmGFP表達。從干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞中抽提總RNA，Nanodrop核酸定量分析儀測定RNA的濃度。按照Fermentas公司的M-MLV操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用SYBR Green實時熒光定量PCR法分別檢測目的基因的表達(人EGFL7上游引物5’-GATGGCGGGGTGACACTTG-3’，下游引物5’-CACTGTCCACTCCTGTCGGG-3’;人 GAPDH 上游引物 5’-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATG-3’，下游引物 5’-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’)，選取干擾效率最高的質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。

3．2 人EGFL7基因RNAi慢病毒表達載體的構(gòu)建

以構(gòu)建好的干擾效率最高的 pcDNA6．2-GW/EGFL7為模板，Lenti-Asc1-F/Lenti-Pme1-R為引物(根據(jù) pLenti6．3-MCS/V5-DEST載體結(jié)構(gòu)設計)，PCR擴增EmGFP-EGFL7-miR片段，使目的片段兩末端分別帶上酶切位點Asc I和Pme I。將EGFL7基因PCR產(chǎn)物和pLenti6．3-MCS/V5-DEST慢病毒載體用Asc I和Pme I分別進行酶切，T4 DNA ligase連接上述酶切后的PCR產(chǎn)物及慢病毒載體。將10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，次日挑取單菌落行菌落PCR，將PCR鑒定呈陽性的克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中，搖菌過夜，次日抽提質(zhì)粒，送測序驗證，命名為 pLenti6．3-EGFL7-miR。

3．3 慢病毒包裝及滴度測定 用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋EGFL7基因pLenti6．3-EGFL7-miR干擾質(zhì)粒和Packaging Mix(Invitrogen)包裝質(zhì)粒，在 POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent介導下轉(zhuǎn)染293T細胞。37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。收獲含病毒的上清液，4℃、3 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片。用0．45μm醋酸纖維素膜的濾器過濾上清液于Beckman SW28離心管中，每管30 mL病毒上清，然后將2 mL 20%蔗糖溶液(PBS配制)輕輕加入上清液的底部，形成一個蔗糖墊，4℃、25 000 r/min離心3 h。離心完畢后小心取出超速離心管，小心棄去上清液，留下管底少量的半透明或白色沉淀。將超速離心管倒置在吸水紙上晾干，并用Tip頭吸去管壁上多余的液體。100μL冷PBS重懸，并輕輕吹打溶解沉淀，注意避免產(chǎn)生氣泡，分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以5×108/L的密度將293T細胞接種于24孔板。細胞換液，將梯度稀釋的含病毒培養(yǎng)基分別加入各孔中，同時加入8 mg/L polybrene以增加干擾效率。感染24 h后，更換完全培養(yǎng)基于37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。感染72 h后觀察熒光表達情況，選取合適稀釋度對應的孔，對EmGFP陽性細胞進行計數(shù)，并依此計算待測慢病毒的滴度。

3．4 穩(wěn)定干擾EGFL7表達的細胞株篩選 將處于對數(shù)生長期的HEp-2細胞以密度5×108/L接種于6孔板，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)待細胞融合度達到約30% ～50%，分別用pLenti6．3-EGFL7-miR目的病毒和空白病毒顆粒感染HEp-2細胞(MOI=10)，同時加入8 mg/L polybrene增強感染。慢病毒感染48～72 h后觀察熒光，感染效率大于70%時，加入6 mg/L殺稻瘟菌素(blasticidin，BSD)進行藥物篩選，14 d后挑取單克隆，擴大培養(yǎng)。SYBR Green實時熒光定量PCR法(參考方法3．1)鑒定EGFL7穩(wěn)定干擾的細胞，命名為 HEp-2pLenti6．3-EGFL7-miR。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 EGFL7基因有效干擾質(zhì)粒 pcDNA6．2-GW/EmGFP-EGFL7的構(gòu)建和篩選

針對目的基因EGFL7 cDNA序列，設計并合成4對特異性miRNA Oligo，見表1。4對miRNA Oligo退火后形成ds Oligo，與線性化的pcDNA6．2-GW/EmGFP-miR RNAi質(zhì)粒連接，經(jīng)測序驗證，質(zhì)粒構(gòu)建成功。

表1 人EGFL7基因4對特異性寡核苷酸干擾序列Table 1．Specific Oligo sequences for human EGFL7 gene RNA interference

4種候選干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后，熒光顯微鏡下均可觀察到EmGFP表達，見圖1，轉(zhuǎn)染效率達90%以上。進一步采用實時熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒pcDNA6．2-GW/EGFL7-1干擾效果欠佳，而質(zhì)粒 pcDNA6．2-GW/EGFL7-2、pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 和 pcDNA6．2-GW/EGFL7-4的干擾效應均高于50%，其中質(zhì)粒pcDNA6．2-GW/EGFL7-3的干擾效應高達69%，見圖2，故選擇質(zhì)粒pcDNA6．2-GW/EGFL7-3用于后續(xù)實驗。

2 EGFL7基因 pLenti6．3-EmGFP-EGFL7-miR 慢病毒表達載體的構(gòu)建

以干擾效率最高的pcDNA6．2-GW/EGFL7-3為模板，Lenti-Asc1-F/Lenti-Pme1-R為引物，PCR擴增EmGFP-EGFL7-miR片段，電泳可見清晰的目的基因條帶，見圖3。EGFL7基因 PCR產(chǎn)物與 pLenti6．3-MCS/V5慢病毒載體經(jīng)雙酶切連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，行菌落PCR鑒定陽性克隆(圖4A)。最后，將陽性克隆的菌落接種到LB培養(yǎng)基中，搖菌過夜，抽提質(zhì)粒，再次PCR和酶切鑒定(圖4B)，并送測序，證實干擾靶點插入序列正確。

3 慢病毒包裝及滴度測定

在 POLOdelivererTM3000介導下將 pLenti6．3-EGFL7-miR重組慢病毒載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，熒光顯微鏡觀察可見大量綠色熒光蛋白的表達。收集并濃縮病毒后，經(jīng)逐孔稀釋滴度測定法測定病毒滴度為5×1011TU/L。

4 穩(wěn)定干擾EGFL7表達的喉癌HEp-2細胞株篩選鑒定

分別用pLenti6．3-EGFL7-miR病毒和空白病毒感染HEp-2細胞，于感染后48～72 h加入BSD進行藥物篩選，2周后篩選出穩(wěn)定克隆，見圖5。采用實時熒光定量PCR法檢測證實，穩(wěn)定干擾EGFL7基因表達的HEp-2細胞與空白病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞相比，EGFL7 mRNA表達下降了97%，干擾效果明顯(P＜0.05)，見圖6。

Figure 1．GFP expression in 293T cells 48 h after transfection(×10)．A:non-transfection group;B:negative control group;C:pcDNA6．2-GW/EGFL7-1 transfection group;D:pcDNA6．2-GW/EGFL7-2 transfection group;E:pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 transfection group;F:pcDNA6．2-GW/EGFL7-4 transfection group．圖1 4種候選干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后綠色熒光蛋白的表達

Figure 2．Relative expression of EGFL7 mRNA after transfection．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs negative control group．圖2 4種候選干擾質(zhì)粒對EGFL7 mRNA表達的影響

Figure 3．PCR results for pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 vector．1:marker;2:PCR product of pcDNA6．2-GW/EGFL7-3 plasmid using Lenti-Asc1-F and Lenti-Pme1-R primers．圖3 pcDNA6．2-GW/EGFL7-3載體的PCR結(jié)果

Figure 4．Identification of the constructed pLenti-6．3-EGFL7-miR vector．A:colony PCR for cloned target gene．1:marker;2 ～8:the groups with transformants of pLenti6．3-EGFL7-miR;9:the group with positive control;10:the group with ddH2O．B:enzyme digestion．1:marker;2:pLenti6．3-EGFL7-miR vector digested by Asc I and Pme I．3:negative vector without digestion．圖4 慢病毒載體的PCR和酶切鑒定

Figure 5．GFP expression in HEp-2 cells 2 weeks after pLenti-6.3-EGFL7-miR transfection(×10)．A:non-transfection group;B:negative control group;C:pLenti-6.3-EGFL7-miR transfection group．圖5 慢病毒轉(zhuǎn)染HEp-2細胞經(jīng)BSD篩選2周后綠色熒光蛋白的表達

Figure 6．Relative expression of EGFL7 mRNA after pLenti6．3-EGFL7-miR transfection．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs negative control group．圖6 慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染喉癌HEp-2細胞后EGFL7 mRNA表達情況

討 論

喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，也是一種主要經(jīng)過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤。雖然近年來診斷和治療水平均有提高，但喉癌患者的5年生存率并無顯著改善［6］，腫瘤的局部復發(fā)、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移是影響喉癌患者預后的主要因素。研究表明具有不同遺傳背景的惡性腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的步驟基本相似，包括原發(fā)瘤生長、新生血管形成、腫瘤細胞脫落、血管或淋巴管轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移瘤形成等過程。近年來，國內(nèi)外許多學者從不同的環(huán)節(jié)和角度探討癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制，已證實血管生成參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)［7］:不僅原發(fā)瘤的生長依賴血管生成，癌細胞從原發(fā)灶脫落進入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生轉(zhuǎn)移以及新的轉(zhuǎn)移灶生長也依賴血管生成。

EGFL7是血管管腔形成所必需的因子，其缺乏將導致管腔形成受阻，影響血管功能的完善。哺乳動物EGFL7基因?qū)儆谛』蚣易澹琒oncin等［1］用EGFL7探針進行熒光原位雜交(FISH)染色顯示人類和小鼠的EGFL7基因分別定位于9號和2號染色體上，編碼一個相對分子量為30 kD的蛋白，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞黏附、指導內(nèi)皮細胞遷徙以及抑制血管平滑肌細胞遷徙的作用。

最初研究表明，EGFL7是胚胎發(fā)育血管形成過程中必不可少的因子［1］;隨后的研究證實，在人、小鼠及斑馬魚胚胎期和新生兒期的原始內(nèi)皮細胞、各種血管內(nèi)皮細胞及心內(nèi)膜中均可檢測到EGFL7持續(xù)高水平表達［3］;而在幾乎所有成年個體的成熟組織中EGFL7均表達下調(diào)，在成年小鼠的一些富含血管的器官如肺臟、心臟和腎臟中有部分血管持續(xù)性表達EGFL7，可能與這些器官在出生后仍然有血管生成和改建有關(guān);在一些增殖性組織，如腫瘤、血管損傷、妊娠期子宮及炎癥組織［8-9］中出現(xiàn)大量血管新生的現(xiàn)象，其EGFL7的表達呈明顯上調(diào)。我們研究發(fā)現(xiàn)，喉癌組織中EGFL7表達較癌旁非腫瘤喉黏膜組織上調(diào)，且其表達水平與腫瘤臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預后有關(guān)，是喉癌預后的獨立預測因子［4］。然而，EGFL7究竟在喉癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮怎樣的功能，仍不清楚，因此本研究通過構(gòu)建EGFL7基因的RNA干擾(RNA interference，RNAi)載體及穩(wěn)定干擾其表達的喉癌細胞克隆亞系，為今后進一步開展其功能研究奠定基礎。

RNAi是正常生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一種現(xiàn)象，是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象［10］。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，RNAi被廣泛用于特定基因表達的抑制及“滅活”，成為研究特定基因功能的有效工具［11］。體內(nèi)RNAi表達載體有質(zhì)粒載體和病毒載體2種，其中病毒載體既能轉(zhuǎn)染分裂細胞，亦可轉(zhuǎn)染靜止細胞，既可以瞬時轉(zhuǎn)染也可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、并且能提供高的轉(zhuǎn)染效率(接近100%)［12］，因此在實驗研究中得到廣泛應用。

目前主要有4種類型的病毒載體［13］:逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體和單純皰疹病毒載體。慢病毒載體是以HIV-1為基礎發(fā)展起來的基因治療載體。有別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，慢病毒載體是目前感染效率最高的載體，其又可分為整合型載體和非整合型載體兩種不同的類型。整合型慢病毒載體具有將目的基因整合至靶細胞基因組，可長期表達、免疫反應小等特點［14］。基于慢病毒載體的上述特點，我們采用復制缺陷型慢病毒作為人EGFL7基因RNAi的載體。

本研究通過生物信息學方法，針對人EGFL7基因序列，設計并合成4對EGFL7基因特異性干擾片段，構(gòu)建并篩選出干擾效率最高的質(zhì)粒，再與慢病毒載體進行重組，成功構(gòu)建出EGFL7的RNAi慢病毒載體，病毒滴度達5×1011TU/L。pLenti6．3-EGFL7-miR病毒感染喉癌細胞HEp-2，經(jīng)BSD篩選2周得到穩(wěn)轉(zhuǎn)株，采用實時熒光定量PCR檢測顯示穩(wěn)定干擾EGFL7基因表達的HEp-2細胞與空白病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞相比，EGFL7 mRNA表達下降了97%，干擾效果明顯。本研究中穩(wěn)定干擾EGFL7表達喉癌細胞亞系的建立為今后深入探討EGFL7蛋白的功能及其與喉癌發(fā)展發(fā)生的關(guān)系奠定了基礎。