TGF-β1介導的RhoA/ROCK通路在大鼠肺肌成纖維細胞分化中的調節作用*

馬文東， 袁 媛， 楊 奕， 徐 洪， 鄧海靜， 于婉瑩， 孫 月， 魏中秋， 楊 方△

(河北聯合大學1醫學實驗研究中心，2教務處，3病理學教研室，河北唐山063000)

以往的研究認為，在致肺纖維化各種刺激因素的作用下，肺間質成纖維細胞的增殖與合成大量細胞外基質是肺纖維化發生發展的關鍵環節。然而近期的研究發現，在長期受到致纖維化因素刺激時，肺間質成纖維細胞和上皮細胞，會發生表型轉變并分化為肌成纖維細胞(myofibroblast)。肌成纖維細胞能特異表達α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)，被認為是(矽)肺纖維化形成過程中產生過量細胞外基質最主要和最重要的細胞［1-2］。而轉化生長因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是研究最多、最為深入并誘導肌成纖維細胞分化效果最為明顯的細胞因子之一［3-5］。近年來研究發現TGF-β介導的Rho相關卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil-forming protien kinase，ROCK)信號轉導通路在器官纖維化形成中發揮著重要作用［6］。本實驗旨在觀察與探討TGF-β1刺激誘導的RhoA/ROCK信號轉導途徑在調控肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化過程中的作用，為進一步深入研究(矽)肺纖維化形成機制提供一些實驗的依據。

材料和方法

1 肺成纖維細胞培養

取新生Wistar大鼠，胰酶消化法獲得原代培養的肺成纖維細胞，取第4代細胞用于實驗。誘導前將細胞調整同步化后，實驗被分為2部分:第1部分給予TGF-β1誘導刺激肺成纖維細胞0 min、5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 和 48 h。第2部分將細胞分為3組:(1)對照組:0．4%血清濃度的DMEM培養液;(2)TGF-β1誘導刺激組:0．4%血清濃度的 DMEM培養條件下，給予 TGF-β1(5μg/L)刺激后孵育細胞;(3)Y-27632干預組(Rho/ROCK通路阻滯劑組):為0．4%血清濃度的DMEM培養條件下，給予RhoA/ROCK通路特異性阻滯劑Y-27632(10 mg/L)預孵育1 h后，再給予TGF-β1(5μg/L)共同孵育，選擇誘導6 h、12 h和24 h 3個時點進行實驗。

2 主要試劑

重組人 TGF-β1(Peprotech)、Y-27632(Cayman Chemica);GAPDH I抗(Santa Cruz)、β-actin I抗(Santa Cruz);I型、III型膠原 I抗(BA2023、BA0326，武漢博士德)、α-SMA I抗(Epitomics)、ROCK-I I抗(Epitomics)、血清反應因子(serum response factor，SRF)I抗(Santa Cruz);p-RhoA(Ser188)I抗(Affinity)、RhoA I抗(Affinity);肌球蛋白磷酸酶靶亞基(myosin phosphatase target subunit，MYPT;亦稱為myosin-binding subunit of myosin light chain phosphatase，MBS)I抗(Anbo);p-MBS(Thr850)I抗(Millipore)。

3 主要方法

3．1 免疫細胞化學染色法檢測α-SMA在肺成纖維細胞的表達 常規制備細胞爬片，多聚甲醛固定2 h。免疫細胞化學染色按說明書進行，其中α-SMA抗體濃度為1∶200，DAB顯色。染色時設置陰性對照，PBS取代I抗。將染色后的細胞爬片經IPP 7．0圖像分析軟件進行圖像采集。

3．2 Western blotting檢測 ROCK、SFR、α-SMA、I型和III型膠原蛋白的表達 RIPA蛋白裂解液裂解、離心，吸取上清。以考馬斯亮藍R-250染色測定蛋白濃度后，以每泳道50μg蛋白含量上樣，常規電泳并轉膜。5%牛血清白蛋白37℃封閉1 h，在膜上滴加封閉液稀釋的抗大鼠的抗體(β-actin和GAPDH抗體1∶500稀釋;余抗體1∶100稀釋)，4℃孵育過夜。II抗(1∶3 000 稀釋)37 ℃孵育1 h。BCIP/NBT(1∶50稀釋)顯色。見有清晰條帶出現即用雙蒸水終止顯色。用掃描儀對PVDF膜上蛋白表達條帶進行圖像掃描，以ImageJ軟件對蛋白表達條帶進行平均吸光度值(average absorbance，A)的定量分析，經內參平衡(GAPDH或β-actin)后，以對照組的倍數作為該蛋白的相對表達量)。

4 統計學處理

數據以均數±標準差(mean+SD)表示，用SPSS 13．0軟件進行完全隨機設計的單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 TGF-β1誘導不同時點 p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白表達的變化

免疫細胞化學染色結果顯示(圖1)，經TGF-β1誘導后大鼠肺成纖維細胞形態由未加刺激時的瘦長梭形逐漸轉變為寬大、多邊形，胞體內出現大量平行或交叉排列的α-SMA抗體標記的肌絲。其中誘導3 h即可見胞體內肌絲，24 h幾乎所有的細胞胞體內均有肌絲，細胞都轉化為肌成纖維細胞。Western blotting法結果顯示(圖2、表1)，經 TGF-β1分別刺激0 min、5 min、15 min、30 min、45 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h和48 h，p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白表達均在刺激5 min后表達即開始上調。其中p-RhoA、ROCK和p-MBS蛋白多在6 h左右達到峰值，是誘導前的2倍左右;SRF蛋白在12 h達到峰值，是誘導前的4．55倍;α-SMA表達在24 h達到峰值，是誘導前的4．06倍;I型膠原蛋白和III型膠原蛋白表達在24 h達到峰值，分別為誘導前的2．19和3．04 倍。

Figure 1．The expression ofα-SMA in rat pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1 measured by immunocytochemistry(× 400)．Treatment with TGF-β1．A:0 min;B:3 h;C:6 h;D:12 h;E:24 h;F:48 h．The arrows indicate the positive expression ofα-SMA．圖1 TGF-β1刺激后肌絲樣結構隨時間變化在大鼠肺成纖維細胞內分布與表達情況

Figure 2．The expression of p-RhoA，ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts time-dependently induced by TGF-β1．圖2 TGF-β1誘導刺激不同時點 p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白的表達

表1 TGF-β1誘導刺激不同時點 p-RhoA、ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原蛋白表達的變化Table 1．The expression of p-RhoA，ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts time-dependently induced by TGF-β1(Mean ± SD．n=3)

2 Y-27632 對 TGF-β1誘導 ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型膠原和III型膠原蛋白在細胞中表達的影響

Western blotting法結果顯示(圖 3、表 2)，經TGF-β1誘導6 h、12 h和24 h后，ROCK 表達增加，分別是相應時點對照組的1．98倍、1．46倍和1．72倍。給予Y-27632預處理后，ROCK表達顯著下降，在6 h、12 h和24 h各時點分別是TGF-β1誘導組的48.48%、54．79% 和 50．62%，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

TGF-β1誘導6 h、12 h 和24 h 后，p-MBS/t-MBS表達增加，分別是相應時點對照組的2.25、2.78和1.95倍。給予Y-27632預處理后，p-MBS/t-MBS表達顯著下降，在6 h、12 h和24 h各時點分別是TGF-β1誘導組的64.00%、45.02%和54.86%，差異有統計學意義(P＜0.05)。

TGF-β1誘導6 h、12 h和 24 h后，SRF 表達增加，分別是相應時點對照組的2.01、2.76和2.62倍。給予Y-27632預處理后，SRF表達顯著下降，在6 h、12 h和 24 h各時點分別是 TGF-β1誘導組的60.70%、43.75%和33.20%，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

TGF-β1誘導6 h、12 h 和24 h 后，α-SMA 表達增加分別是相應時點對照組的1.48倍、1.53倍和2.13倍。給予Y-27632預處理后，α-SMA表達下降，在6 h、12 h和 24 h各時點分別是 TGF-β1誘導組的43.24%、59.18%和45.83%，差異有統計學意義(P ＜0.05)。

經 TGF-β1誘導6 h、12 h 和24 h 后，I型膠原表達逐漸增加，分別是相應時點對照組的1.83倍、1.64倍和1.89倍。給予Y-27632預處理后，I型膠原表達下降，在6 h、12 h和24 h 3個時點分別是TGF-β1誘導組的43.17%、56.29%和51.89%，差異有統計學意義(P＜0.05)。經TGF-β1誘導6 h、12 h和24 h后，III型膠原表達增加，分別是對照組的1.89倍、1.57倍和2.20倍。給予Y-27632預處理后，III型膠原表達下降，在6 h、12 h和24 h各時點分別是 TGF-β1誘導組的 60.32%、41.03% 和43.96%，差異有統計學意義(P＜0.05)。

討 論

矽(塵)肺是由于長期吸入含二氧化硅(SiO2)粉塵而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主要表現的疾病，其主要的病理學變化為肺間質細胞增殖和細胞外基質(包括膠原蛋白)過多沉積導致肺的纖維化。在矽(塵)肺形成過程中，SiO2粉塵刺激肺泡巨噬細胞產生的各種細胞因子和活性物質是矽肺纖維化發生的重要因素，其中TGF-β1是目前公認的最為重要的致矽肺纖維化的因子之一［1-3］。體外研究也證實，采用SiO2刺激巨噬細胞或提取的灌塵老鼠肺泡灌洗液中的巨噬細胞，其培養上清 TGF-β1含量明顯增加，能夠顯著誘導成纖維細胞的增殖和膠原合成，以及促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化［4-5］。而肌成纖維細胞其收縮、遷移和合成細胞外基質的能力與功能遠遠大于肺間質的成纖維細胞，是器官纖維化形成過程中產生過量細胞外基質的最主要和最重要的細胞，在器官纖維化的發生與發展過程中具有重要意義［2-4］。Wang 等［7］報道，在大鼠單側輸尿管結扎致腎小管間質纖維化模型中，腎組織中TGF-β1、單核細胞趨化蛋白1、核因子κB和α-SMA的表達均較對照組(沒有進行輸尿管結扎)明顯升高，腎小管間質內膠原的分布增多，膠原沉積增加。Peng等［8］應用TGF-β1誘導刺激人胚胎心臟成纖維細胞24 h后，細胞胞漿內出現較明顯的α-SMA和胚胎型平滑肌肌球蛋白表達陽性的肌絲結構，其蛋白表達水平明顯增加，同時細胞合成、分泌的膠原含量升高。Lomas等［9］最近報道在人特發性肺纖維化患者肺組織纖維化聚集區，TGF-β1表達明顯升高，而α-SMA和I型膠原表達也明顯增加。認為在特發性肺纖維化形成過程中，TGF-β1刺激間質細胞的分化和膠原的合成與積聚密切相關。以往較多研究表明TGF-β1可以通過對Smad、細胞外信號調節激酶和蛋白激酶A等信號轉導通路的調節促進靶器官間質細胞向肌成纖維細胞的分化［8，10］。然而，近年來有學者發現TGF-β1能夠通過介導Rho信號轉導通路的激活，調控肌成纖維細胞的分化。其可能的調節路徑為，TGF-β1通過其受體介導，激活靶細胞胞漿內的Rho(也稱之small GTPase)，活化的Rho依次激活其下游的靶蛋白即ROCK，ROCK活化后抑制胞漿內肌動蛋白磷酸酶的活性，從而誘導了肌動蛋白輕鏈的磷酸化和張力纖維的聚集，促進了靶細胞α-SMA蛋白的表達和胞漿骨架蛋白的重構［6，10-13］。SRF是 α-SMA上游的核轉錄因子，參與介導α-SMA表達的調控［10］。

Figure 3．Effects of Y-27632 on the expression of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1．C:control;T:TGF-β1;Y:TGF-β1+Y-27632．圖3 Y-27632對TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型和III型膠原表達的影響

表2 Y-27632對TGF-β1誘導的大鼠肺成纖維細胞ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA、I型膠原和III型膠原蛋白表達的影響Table 2．Effects of Y-27632 on the expression of ROCK，p-MBS，SRF，α-SMA，collagen I and collagen III in rat pulmonary fibroblasts induced by TGF-β1(Mean ±SD．n=3)

本研究發現，隨著 TGF-β1刺激細胞時間的延長，肺成纖維細胞開始由瘦長梭形逐漸轉變為寬大、多邊形，細胞表型發生了較明顯的轉變。當誘導刺激3 h時，胞體內可見明顯α-SMA抗體標記的肌絲出現，并隨著時間延長平行與交叉排列的肌絲成分越來越多，當誘導刺激24 h時，幾乎所有細胞胞體內均有肌絲表達，即細胞均轉化為了肌成纖維細胞。

與對照組相比較，TGF-β1刺激后的細胞中RhoA/ROCK/p-MBS蛋白表達量顯著增多，在誘導刺激6 h左右，RhoA/ROCK相關信號轉導蛋白表達量就明顯上調。作為其下游效應因子的核轉錄因子SRF蛋白的表達量也明顯增多，在12 h左右SRF蛋白表達量達到峰值。同時，細胞中α-SMA蛋白的表達量隨時間增加逐漸增多，I型和III型膠原蛋白的表達量也明顯增加，均在24 h達到峰值。這一過程似乎提示了TGF-β1誘導激活ROCK通路后，隨后活化SRF，并進一步調控α-SMA的表達，刺激誘導了肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化，進而促進I型和III型膠原蛋白的合成與表達。

當給予ROCK通路特異性阻滯劑Y-27632干預后，ROCK、p-MBS、SRF、α-SMA 以及 I型和 III型膠原蛋白的表達在各相應時點均明顯減少。這提示ROCK通路特異性抑制劑Y-27632可以有效抑制這一過程，也從另一個方面證實了 TGF-β1介導的ROCK信號轉導通路的激活對于調控肺成纖維細胞向肌成纖維細胞分化、促進膠原蛋白合成、進而促進(矽)肺纖維化的形成具有重要的意義。