二氧化硫對大鼠肢體缺血再灌注所致肺損傷的影響及其作用機制*

黃新莉， 周君琳， 黎 寧， 范伯元

(1河北醫科大學病理生理教研室，河北石家莊050017;2首都醫科大學附屬北京朝陽醫院骨科，北京100020;3石家莊市第三醫院骨科，河北石家莊050011)

肢體缺血是臨床常見的病理征象，盡管恢復其血液循環是挽救肢體所必須的，但是缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)不僅可能加重局部缺血組織的損傷，嚴重時尚可引起全身炎癥反應綜合征，甚至遠隔的多臟器功能障礙綜合征，其中肺是易受累的首位靶器官，表現為急性肺損傷(acute lung injury，ALI)甚至急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)［1］，病死率極高。盡管關于肢體IR后ALI的發病機制迄今尚未完全闡明，但現在較為公認的看法是肢體IR使機體的炎癥反應細胞處于激活狀態，繼而出現了失控的全身炎癥反應。此時多形核中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)在肺部大量聚集是肺損傷發生的中心環節［2］。肺是氣體交換的場所，氣體分子對肺的影響尤為重要，“氣體信號分子家系”的發現將肺損傷等疾病的研究帶入了一個全新的階段［3］。自上世紀80年代以來，已陸續證實代謝產生的內源性氣體分子一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)可以作為信號分子參與機體穩態調節，并且具有重要的生理和病理生理意義，由此開創了“氣體信號分子家系”的新領域。新近，另外一個小分子氣體物質二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)的生物學效應開始引起人們的關注。SO2是全球性的常見大氣污染物，其暴露的主要毒害是對人和嚙齒類動物的呼吸道產生刺激和腐蝕作用，并與一些呼吸系統疾病(例如氣管炎、哮喘、肺氣腫等)的發生有關［4］，但SO2也可由健康人體含硫氨基酸的代謝轉化產生。最新研究顯示［5］，內源性SO2具有改變心率、降低血壓、擴張血管等效應，可能是一種新的信使分子關于內源性SO2對肺損傷作用的研究較少。Jin等［6］研究顯示，SO2可以使野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺及血漿中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶水平明顯增高，具有一定的抑制氧化損傷作用。本課題組研究證實外源性SO2可抑制脂多糖所致大鼠肺損傷時肺組織中的炎癥反應從而減輕肺損傷的程度［7］。本實驗旨在觀察大鼠肢體IR致ALI時SO2及其生成關鍵酶天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)的變化以及SO2供體亞硫酸鈉/亞硫酸氫鈉(Na2SO3/NaHSO3)和AST抑制劑異羥肟酸(hydroxamate，HDX)對此種肺損傷的影響，以探討內源性和外源SO2對大鼠肢體 IR所致 ALI的作用及可能機制。

材料和方法

1 材料

Na2SO3/NaHSO3、HDX及其它化學試劑均購自Sigma。臨用前Na2SO3/NaHSO3用無菌注射用水以3∶1(0．54 mmol/kg∶0．18 mmol/kg)新鮮配制混合液，作為外源性 SO2供體。HDX按 0．47 mmol/kg以無菌注射用水新鮮配制，無菌注射用水和生理鹽水購自本院藥房。丙二醛(malondialdehyde，MDA)、AST、細胞因子試劑盒和細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)單克隆抗體均購自北京中杉公司。體重為250～300 g的健康SD雄性大鼠(河北醫科大學動物試驗中心)。其它試劑均為分析純。

2 方法

2．1 動物模型 按照 Cohen等［8］提供的方法復制肢體IR致ALI動物模型。體重為250～300 g的健康SD雄性大鼠(河北醫科大學動物試驗中心)用苯巴比妥鈉(40 mg/kg，腹腔注射)麻醉。分離左側頸外靜脈及右側頸總動脈插管以補液(乳酸林格氏液2 mL/h)、給藥及采血。以橡皮止血帶綁扎雙后肢根部造成肢體缺血，4 h后松開止血帶使肢體血流再灌注。應用激光多普勒(Pri Flux 5001型，Perimed)探測血流以保證肢體的缺血和再灌注。

2．2 實驗分組 將96只SD大鼠隨機分為6組:假手術(sham)組、sham+SO2組、sham+HDX組、IR組、IR+SO2組和IR+HDX組。對照組動物給予同樣的麻醉和操作，只是不造成肢體缺血。IR組動物雙后肢缺血4 h再灌注4 h。于再灌注前10 min和相應的對照時點靜脈給予藥物處理:IR+SO2和sham+SO2組分別給予Na2SO3/NaHSO30．5 mL;HDX+IR和HDX+sham組動物分別給予 HDX 0．5 mL;sham組和IR組動物分別給予等量溶劑對照(無菌生理鹽水0．5 mL)。實驗結束時，各組8只動物用于24 h存活情況觀察，另8只動物進行下述指標檢測。

2．3 檢測指標和方法

2．3．1 肺系數測定 自氣管分叉以上第5、6軟骨環間剪斷氣管，將肺臟組織完整取出，用濾紙吸干其表面血污后稱質量。肺系數=全肺濕質量(g)/體質量(kg)。

2．3．2 肺組織學檢查及其PMN計數 取右肺下葉，10%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡下觀察肺組織形態學變化，并隨機計數10個高倍鏡視野(HP)中肺泡間隔PMN平均數目，用以衡量PMN在肺組織中的聚集情況。

2．3．3 肺組織勻漿上清液的制備及蛋白定量 取右肺組織中葉，用預冷的生理鹽水洗去殘血，濾紙吸干，分析天平稱重后。4℃，用電動勻漿器制成10%(W/V)的勻漿。4℃、4 000 r/min離心10 min，吸取上清，進行分裝，采用改良酚試劑法測定蛋白含量，其余 －80℃避光儲存。

2．3．4 肺組織勻漿中MDA含量的檢測 MDA是氧自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發脂質過氧化所形成的產物，故其含量變化可反應組織氧化損傷的程度。應用MDA檢測試劑盒按照其操作說明，采用硫代巴比妥酸比色法檢測肺組織勻漿上清中MDA含量，結果以μmol/L表示。

2．3．5 肺組織SO2水平測定 高效液相色譜(highperformance liquid chromatography，HPLC)熒光法檢測組織SO2水平。100μL肺組織勻漿上清加入70 μL 硼氫化鈉(0．212 mol/L，溶于0．05 mol/L、pH 8．5的Tris液)室溫孵育30 min。加入10μL單溴二胺(70 mmol/L，溶于乙腈)，充分混勻，42℃孵育10 min。加入 40μL高氯酸(1．5 mol/L)混勻，12 400 r/min，離10 min，取上清液，加入 10μL Tris液(2.0 mol/L，pH 3．0)輕輕混勻，12 400 r/min離心8 min，留取上清液進行HPLC(1100型高效液相色譜儀，惠普 Agilent公司)分析。流動相 A:甲醇、乙酸及水的體積比為 5．00∶0．25∶94．75，pH 3．4;流動相B:甲醇(甲醇梯度:0～8 min，50 mL/L;8～15 min，50～120 mL/L;15～20 min，120 mL/L;20～30 min，120～200 mL/L;30～32 min，200 mL/L;32～35 min，200 ～1 000 mL/L;35 ～40 min，1 000 mL/L;40～43 min，1 000～30 mL/L;43～45 min，30 mL/L)。激發波長392 nm，檢測波長479 nm。結果以μmol/g蛋白表示。

2．3．6 肺組織AST水平檢測 采用自動生化儀(Hitachi 7600，Tokyo)檢測肺組織勻漿上清中AST活性，結果以103U/g蛋白表示。

2．3．7 血清中腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α和白細胞介素(interleukin，IL)-1水平的測定 使用ELISA試劑盒測定血清中TNF-α和IL-1濃度，按說明書進行操作。

2．3．8 肺組織ICAM-1蛋白表達的檢測 采用免疫熒光流式細胞術檢測肺組織中ICAM-1的表達:將于70% 乙醇中固定的標本用生理鹽水沖洗后，用搓網法制備單細胞樣品。取1×109/L肺組織細胞，用PBS洗滌2次，每次2 min，1 000 r/min離心去上清液，加入1∶50兔抗大鼠ICAM-1單克隆抗體，在37℃水浴中溫育30 min，用PBS離心洗滌2次，棄上清，加入1∶100稀釋的熒光染料FITC標記的羊抗兔IgG 100μL，37℃溫育30min，離心洗滌2次，棄上清，除去未結合的多余熒光抗體，上機檢測前加入1.0 mL PBS，經400目篩網過濾。同時設有:(1)PBS代替Ⅰ抗的陰性對照;(2)只加Ⅰ抗的陽性對照;(3)只加1∶100 FITC標記的IgG(Ⅱ抗)的陽性對照。以熒光指數(FI)表示ICAM-1蛋白的相對含量，FI=(樣品蛋白表達的平均熒光強度－對照組平均熒光強度)/對照組平均熒光強度。

3 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 10．0統計軟件分析。PMN數量和動物存活率行多樣本均數比較的秩和檢驗(Kruskal-Wallis法)和兩兩比較的秩和檢驗(Nemenyi法)，其它結果行單因素方差分析，有顯著差異者再行q檢驗(Newman-Keul法)進行兩兩比較。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 肺組織形態學和PMN聚集的變化

光鏡下觀察可見，肢體缺血4 h再灌注4 h，肺組織出現水腫、出血及PMN浸潤的組織學變化。應用Na2SO3/NaHSO3后則明顯減輕，而應用HDX處理后上述肺組織學改變進一步加重。與sham組相比，IR組肺泡間隔中 PMN數目顯著增高(P＜0.05);與IR組相比，IR+HDX組肺組織PMN數目進一步增加(P＜0．05)，而IR+SO2組則明顯減少(P ＜0．05);sham、sham+HDX 和 sham+SO2組之間無顯著差異(P ＞0．05)，見圖1、表1。

2 肺系數和肺組織中MDA含量的變化

各組大鼠二者的變化趨勢一致。與sham組相比，IR組明顯增高(P＜0．05)，與IR組相比，I/R+HDX組進一步增高(P＜0．05)，而IR+SO2組則明顯減少(P＜0．05);sham、sham+HDX和 sham+SO2組之間無顯著差異(P＞0．05)，見表1。

Figure 1．Effects of SO2 on rat lung tissue structure following IR of hind limbs(HE staining，×400)．A:sham group;B:sham+SO2 group;C:sham+HDX group;D:IR group;E:IR+HDX group;F:IR+SO2 group．圖1 SO2對大鼠肢體IR致肺損傷時肺組織結構的影響

表1 SO2對大鼠肢體IR致肺損傷時肺組織PMN數目、LW/BW和MDA含量的影響Table 1．Effects of SO2 on lung PMN number，LW/BW and MDA content following IR of hind limbs in rats(Mean±SD．n=8)

3 動物24 h存活率

Sham組動物全部存活，存活率為100%;而IR后大鼠死亡4只，動物24 h存活率(50%)顯著降低(P＜0．05);與I/R組相比，動物24 h存活率IR+HDX 組(37．5%)降低，而 IR+SO2組(62．5%)則明顯提高(均P＜0．05);sham、sham+HDX和 sham+SO2組動物均全部存活。

4 肺組織SO2含量和AST活性的變化

與sham組相比，sham+SO2組SO2含量顯著增高(P＜0．05)，AST活性無顯著變化(P ＞0．05)，sham+HDX組SO2含量和AST活性均顯著降低(P＜0.05)。與sham組相比，IR組SO2含量和AST活性均顯著降低(P＜0.05);與IR組相比，I/R+HDX組二者進一步降低(P＜0.05)，而IR+SO2組SO2水平顯著提高(P＜0．05)，AST活性無顯著變化(P ＞0.05)，見表2。

表2 各組大鼠肺組織中SO 2含量和AST活性的變化Table 2．Changes of SO2 concent and AST activity in lung of rats(Mean±SD．n=8)

5 血清細胞因子和肺組織中ICAM-1表達的變化

與sham組相比，IR組IL-1、IL-6和 IL-10水平升高，肺組織中ICAM-1蛋白表達量顯著增加(P＜0．01)。與IR組相比，I/R+HDX組IL-1和IL-6進一步增高(P＜0.05)、IL-10水平無顯著變化(P＞0.05)，IR+SO2組IL-1和IL-6顯著降低、IL-10水平則顯著增高(P＜0.05);sham組和sham+HDX組之間相比無統計學差異(P＞0.05)，見表3。

表3 SO2對肢體IR所致肺損傷鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達和血清中IL-1、TNF-α含量的影響Table 3．Effects of SO2 on ICAM-1 expression in the lung tissues，and IL-1 and TNF-α levels in the serum of rats with IR-induced lung injury(Mean±SD．n=8)

討 論

SO2是全球性的常見大氣污染物，大劑量、長時間暴露會對環境和人體造成較大危害。已證實，高濃度的SO2及其衍生物，不僅可損害支氣管和肺，還可損害胃腸道、肝、腎、心臟及神經系統，對機體各個臟器均可造成損傷［9］。一些學者提出了大氣中SO2的健康危害閾值:成年人為0．8 mg/m3，兒童為0．6 mg/m3，超過該閾值，呼吸系統疾病的發病率會顯著增加［10］。但是，SO2也可由健康人體含硫氨基酸的代謝轉化產生。L-半胱氨酸在半胱氨酸氧化酶的作用下氧化為L-半胱氨酰亞磺酸，后者在GOT的作用下轉氨基生成 β-亞磺酰丙酮酸，后者自發分解為丙酮酸和SO2。在體內，SO2與水結合產生其衍生物亞硫酸氫鹽和亞硫酸鹽(HSO3－/SO32－)，二者量(摩爾)比為 1∶3。SO32－再經亞硫酸氧化酶的氧化作用生成SO42－排出體外，其中仍有一小部分SO2以游離形式存在。正常人血清亞硫酸鹽濃度在 0～9.85 μmol/L 之間［11］;大鼠血漿 SO2濃度為(16.77 ±8.24)μmol/L，胸主動脈血管組織 SO2濃度為(127.76 ±31.34)μmol/L［12］。那么，機體產生和存在的SO2有何作用呢?隨著對新型小分子氣體信使如NO、CO、H2S等作用的不斷發現，學者們開始對SO2的生理作用產生興趣。近來研究發現，內源性SO2是一種血管舒張因子，在生理相關濃度或低濃度下(1～2 mmol/L)具有顯著的、劑量依賴性的血管舒張作用［13］，具有降低肺動脈高壓和高血壓等作用。表明，SO2可能是繼NO、CO、H2S之后新發現的又一重要信使分子。

本研究在大鼠肢體 IR所致ALI模型上發現大鼠肢體IR致肺損傷時，肺內SO2含量和GOT活性下降。為進一步闡明SO2/GOT通路變化的意義，本研究分別觀察了補充SO2以及進一步抑制SO2對此種肺損傷的作用。通過預實驗我們發現SO2供體Na2SO3/NaHSO3(mmol/kg∶mmol/kg)劑量分別為0.135∶0．045、0．27∶0．09、0．54∶0．18 和 0．61∶0．27時可呈劑量依賴性減輕大鼠肢體IR所致肺損傷時肺系數的增高(待發表)。結合預實驗結果及相關文獻報道［6］，本研究采用 0．54 mmol/kg∶0．18 mmol/kg 的Na2SO3/NaHSO3為 SO2供體。結果顯示，Na2SO3/NaHSO3可明顯逆轉大鼠肢體IR所致肺損傷時SO2含量的降低，同時明顯減輕肢體IR所致肺損傷程度、提高動物的存活率;而應用AST活性抑制劑HDX抑制AST活性從而使SO2產生減少則明顯加重此種肺損傷、降低動物的存活率，結果提示肢體IR后肺內SO2/AST體系的下調參與介導了肢體IR后ALI的發生，內源性和外源性 SO2具有抑制肢體 IR所致肺組織損傷的保護作用。0．54 mmol/kg∶0.18 mmol/kg Na2SO3/NaHSO3雖然可明顯提高肺組織SO2水平，但從實驗結果來看其仍在生理水平范圍，理論上不會對正常組織造成損傷，實驗結果也證實如此，即未發現 0．54 mmol/kg∶0．18 mmol/kg Na2SO3/NaHSO3對假手術對照組動物產生明顯損害。張素清等［14］研究顯示SO2可加重大鼠離體心肌的IR損傷，但作者并未檢測組織中SO2的實際水平和變化，而且同一課題組隨后的進一步研究報告顯示，SO2可提高心肌組織內抗氧化酶活性、緩解異丙腎上腺素誘導的心肌損傷［15］，與本研究結果基本一致。

肢體IR引起肺損傷的實質是肺組織中發生了失控的炎癥反應，大量致炎因子和活性氧物質的產生以及PMN在肺部大量聚集是肺損傷發生的中心環節［2］。因此，抗炎、抗氧化、抑制PMN聚集是防治此種損傷的重要策略。本研究通過對肢體IR致ALI時肺組織病理學變化、PMN數目、氧化損傷產物MDA含量和肺系數以及炎癥因子變化的檢測進一步佐證了此種病理生理變化，同時發現抑制內源性SO2產生可使肺內MDA含量、PMN數目和炎癥細胞因子IL-1、IL-6和TNF-α水平進一步增高、肺損傷進一步加重，而補充SO2可明顯降低上述指標變化、減輕肺損傷程度，提示SO2具有抗炎、抗氧化、抑制PMN聚集的作用。

PMN在肺內的聚集是由位于PMN和肺微血管內皮細胞表面的一系列黏附分子(如L-選擇素、P-選擇素、ICAM-1、血管細胞黏附分子1和CD44等)表達上調所介導的;抑制肢體IR所致的黏附分子表達上調是抑制PMN聚集的重要策略。本研究結果發現，肢體IR可明顯上調肢體IR后肺內ICAM-1表達，應用AST活性抑制劑HDX使SO2產生減少后肺內ICAM-1表達進一步增高，應用SO2供體Na2SO3/NaHSO3可使ICAM-1表達顯著降低，提示SO2抑制肢體IR所致ALI及PMN聚集的機制與其抑制黏附分子表達有關。