神經(jīng)元核心抗原和神經(jīng)元特異性烯醇化酶在人胚胎小腸發(fā)育階段的表達(dá)*

劉學(xué)紅， 張 泳

(紹興文理學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 紹興312000)

神經(jīng)元核抗原(neuronal nuclear antigen，NeuN)是一種可溶性核蛋白，表達(dá)于脊椎動物中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)發(fā)育成熟的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，參與細(xì)胞的發(fā)育和損傷修復(fù)，其陽性表達(dá)數(shù)量和強度反映了該區(qū)域神經(jīng)元發(fā)育的成熟程度［1-4］。神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)廣泛存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞漿內(nèi)，對神經(jīng)元具有營養(yǎng)和保護(hù)功能，臨床上常把NSE作為檢測神經(jīng)元損傷敏感性和特異性的生化標(biāo)志物［5-7］。目前關(guān)于NeuN和NSE在神經(jīng)系統(tǒng)病變方面的研究報道較多［8-9］，但關(guān)于NeuN和NSE在人胚胎小腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中細(xì)胞分化、發(fā)育及演變規(guī)律方面的研究，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道甚少。本文通過研究人胚胎小腸壁內(nèi)NeuN和NSE的表達(dá)、分布規(guī)律，探討兩者在小腸生長發(fā)育過程中的作用，旨在為先天性小腸疾病的研究提供形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料收集與分組

收集因意外原因造成人工流產(chǎn)、發(fā)育正常、受精齡為7～16周的人胚胎標(biāo)本16例，每例標(biāo)本均經(jīng)孕婦本人同意和學(xué)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。以每4周為1月齡組，孕4～8周為第2月胎齡組，孕9～12周為第3月胎齡組，孕13～16周為第4月胎齡組，每月齡為一研究組，其例數(shù)分布如下:第2月齡組5例，第3月齡組6例，第4月齡組5例。

2 方法

2．1 取材和免疫組織化學(xué)染色程序 從胎尸內(nèi)取出小腸標(biāo)本，分別從每例標(biāo)本切取約1．0 cm長腸管，用4℃生理鹽水洗凈血液，放入10%中性甲醛水溶液中固定12～24 h后，取出流水沖洗2 h，行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋。石蠟切片，厚4μm，每個標(biāo)本取6片，行免疫組織化學(xué)(NeuN和NSE小鼠抗人單克隆抗體及其輔助試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司):免疫組織化學(xué)程序采用PV法，即切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性酶，滴加Ⅰ抗(抗體濃度均為1∶140)，滴加PV9002(山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體)，DAB顯色(在以上各步之間均用PBS洗滌5 min×3次)，蘇木精輕度復(fù)染，然后脫水，透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2．2 對照實驗 用PBS替代Ⅰ抗、Ⅱ抗作陰性對照，用已知陽性片作陽性對照。

結(jié) 果

切片經(jīng)免疫組織化學(xué)顯色后，NSE陽性細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)/膜呈黃色或深黃色，細(xì)胞核不著色;NeuN陽性細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)呈黃色或深黃色。

1 NSE在小腸組織中的表達(dá)

第2～4月齡段，人胚胎小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)元及神經(jīng)纖維呈NSE強陽性表達(dá)，腸腺內(nèi)有散在分布的NSE陽性細(xì)胞。在小腸黏膜下層，隨著胎齡的增大，NSE陽性表達(dá)細(xì)胞和纖維數(shù)量逐漸增多，見圖1。

Figure 1．Positive NSE expression in human embryonic small intestinal myenteric nerve plexuses(★)，submucosal plexuses(↑)and glands(▲)at the 2nd to 4th months of gestation(immunohistochemical staining)．A，C，E:×100;B，D，F(xiàn):×400．A，B:the 2nd month of gestation;C，D:the 3rd month of gestation;E，F(xiàn):the 4th month of gestation．圖1 人胚胎第2～4月齡時，NSE在小腸肌間神經(jīng)叢、黏膜下神經(jīng)叢和腺體細(xì)胞的陽性表達(dá)

2 NeuN在小腸組織中的表達(dá)

第2～4月胎齡段，人胚胎小腸黏膜層的腺體和上皮組織內(nèi)有散在NeuN陽性細(xì)胞分布，隨著胎齡的增大，NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增多，見圖2。第3月齡段開始，肌間神經(jīng)叢內(nèi)少量細(xì)胞呈NeuN陽性表達(dá)，見圖2C;隨著胎齡增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，見圖2J。

討 論

小腸來源于三胚層時期的臟壁中胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞，在相關(guān)基因的調(diào)控作用下，經(jīng)過細(xì)胞的增殖和凋亡逐漸演變而成。小腸是動物和人類吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場所，是消化管道重要的組成成分。其腸壁內(nèi)含有大量的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并通過神經(jīng)纖維相互連接，形成腸神經(jīng)系統(tǒng)，控制和調(diào)節(jié)小腸的分泌、吸收和運動。小腸黏膜層含有豐富的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，可根據(jù)腸功能需求而分泌相應(yīng)的激素，調(diào)節(jié)黏膜層細(xì)胞的活動。

NeuN是具有46 kD和48 kD 2個亞型，其免疫反應(yīng)性在神經(jīng)元分化成熟后即開始表達(dá)，陽性強度代表神經(jīng)元發(fā)育的成熟程度［10］。NSE是烯醇化酶基因超家族成員之一，是糖酵解的關(guān)鍵酶，在糖酵解途徑中催化α-磷酸甘油生成磷酸烯醇式丙酮酸，特異地存在于神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，對維持神經(jīng)系統(tǒng)生理功能具有重要作用。NSE的含量是成熟神經(jīng)元代謝活性和突觸化的標(biāo)志［5-8］。本研究結(jié)果顯示，第2～4月齡段人胚胎小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)纖維均呈NSE強陽性表達(dá)。第3月齡段開始，肌間神經(jīng)叢內(nèi)少量細(xì)胞呈NeuN陽性表達(dá)，隨著胎齡增大，肌間神經(jīng)叢內(nèi)NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。上述結(jié)果說明人胚胎小腸發(fā)育第2月齡時，肌間神經(jīng)叢內(nèi)大部分細(xì)胞已能大量合成NSE，第3月齡才有少量細(xì)胞能合成NeuN，提示NSE和NeuN可能代表不同類型的成熟神經(jīng)元。NSE可以合成和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)元具有營養(yǎng)和保護(hù)功能。在胚胎小腸發(fā)育早期階段，NSE在肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢的廣泛表達(dá)，這可能與神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化發(fā)育及突觸形成所需大量的營養(yǎng)和信息有關(guān)。Welch等［11］報道豚鼠和大鼠出生3 d時，豚鼠部分腸神經(jīng)元的胞核和胞質(zhì)呈NeuN陽性表達(dá)，而大鼠幾乎所有腸神經(jīng)元的核呈陽性表達(dá)，到了成年，肌間神經(jīng)叢內(nèi)NeuN免疫表達(dá)陽性較弱。Sarnat等［4］通過對第8～24周人胚胎腦神經(jīng)系統(tǒng)中NeuN表達(dá)的研究，得出了隨胎齡增大，神經(jīng)元表達(dá)NeuN明顯增加。這些研究說明NeuN在動物和人的小腸肌間神經(jīng)叢內(nèi)均有表達(dá)，但在表達(dá)時間、數(shù)量及分布規(guī)律上存在一定的差異，人類胚胎小腸和腦神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中確存在相似性。本研究結(jié)果進(jìn)一步顯示，第2～4月胎齡段，人胚胎小腸黏膜層的腺體和上皮組織內(nèi)有散在NeuN陽性細(xì)胞分布，隨著胎齡的增大，NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量增多。腸腺和上皮內(nèi)有散在NSE陽性細(xì)胞分布。這說明NeuN和NSE均參與腸腺和上皮組織的發(fā)育，提示小腸上皮和腺體內(nèi)NeuN和NSE陽性細(xì)胞可能表達(dá)于不同類型的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，它們合成和釋放小腸黏膜層生長發(fā)育所需的內(nèi)分泌激素，調(diào)控小腸黏膜層細(xì)胞的生長和發(fā)育。NeuN陽性細(xì)胞數(shù)量隨著胎齡的增大而增多，可能與人胚胎小腸發(fā)育階段，腸黏膜層隨著胎齡的增大而逐漸增厚，細(xì)胞數(shù)量增多，上皮和腺體增高，其細(xì)胞的生長發(fā)育所需營養(yǎng)和信號的調(diào)控也隨之增加有關(guān)。

Figure 2．Positive NeuN expression in human embryonic small intestinal villi(↑)，glands(▲)and myenteric nerve plexuses(★)at the 2nd to 4th months of gestation(immunohistochemical staining)．A，C，G:×100;B，D，E，F(xiàn)，H，I，J:× 400．A，B:the 2nd month of gestation;C～F:the 3rd month of gestation;G～J:the 4th month of gestation．圖2 人胚胎第2～4月齡時，NSE在小腸絨毛、腺體和肌間神經(jīng)叢細(xì)胞的陽性表達(dá)

綜上所述，人胚胎小腸發(fā)育第2～4月齡段，NeuN主要表達(dá)于腸黏膜上皮和腺體，調(diào)控黏膜層細(xì)胞的生長發(fā)育。NSE主要表達(dá)于腸肌間神經(jīng)叢和黏膜下神經(jīng)叢，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長發(fā)育。NeuN和NSE參與腸壁不同類型細(xì)胞的發(fā)育成熟過程。