腸淋巴液引流減輕失血性休克大鼠脾組織損傷的作用與機制*

劉 華， 邢立強， 趙自剛， 牛春雨

(河北北方學院微循環研究所，基礎醫學院病理生理學教研室，河北張家口075000)

近年來，淋巴系在危重病發病學中的作用受到學者們的關注。目前認為，危重狀態下的腸淋巴液回流是導致機體重要器官結構損傷、功能障礙以及血管低反應性的關鍵因素［1－2］，是危重病發展的橋梁［3］。研究也表明，免疫功能紊亂是引起重癥休克后失控的全身炎癥反應、進而導致器官損傷的重要發病學機制［4］。脾臟含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，通過多種機制調節機體的免疫功能，調節脾組織淋巴細胞亞群平衡對細胞免疫和體液免疫功能均有重要意義［5-8］。課題組前期研究表明，腸淋巴管結扎可調節失血－脂多糖大鼠的體液免疫功能［9］，那么，脾作為重要的免疫器官，腸淋巴液回流與休克后脾的關系如何?值得研究。為此，本研究觀察了腸淋巴液引流對失血性休克大鼠脾組織形態、細胞凋亡及其相關基因的蛋白表達、細胞周期與增殖指數(proliferation index，PI)的影響，進一步探討腸淋巴液在休克發病學中的作用與意義。

材料和方法

1 動物與分組

18只SPF級Wistar雄性大鼠購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心［實驗動物許可證號 SCXK(軍)2007-004］，體重 230 ～270 g，隨機均分為假手術組(sham，僅麻醉與手術)、休克組(shock，復制失血性休克模型)和休克+引流組(shock+drainage，復制失血性休克模型并引流腸淋巴液)。所有動物在實驗前禁食12 h，自由飲水，實驗過程中動物處置符合動物倫理學標準。

2 動物實驗

所有大鼠乙醚誘導麻醉后，經肌肉注射質量分數1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg，德國/北京化學試劑公司分裝)全身麻醉，行股部無菌手術，剝離左股靜脈后插管，注射肝素(1 mL/kg，5×105U/L，國藥集團化學試劑有限公司)抗凝后，插管，通過注射器連接WZF-250F2輸液泵(浙大醫學儀器有限公司)，備輸液;剝離右側股動脈后插管，通過RM6240BD生物信號采集系統(成都儀器廠)連續監測平均動脈血壓(mean artery pressure，MAP);分離左側股動脈后插管，連接注射器至NE-1000微量抽注機(New Era Pump Systems)，備放血。腹部手術，剝離腸淋巴管。待術畢平均動脈血壓穩定30 min后，休克組及休克+引流組大鼠均以抽注機自股動脈勻速放血至40 mmHg(1 mmHg=0．133 kPa)，10 min 完成，保留備回輸;實驗過程中，以調整放血量維持低血壓90 min，復制失血性休克模型。然后，休克組及休克+引流組均應用輸液泵自股靜脈緩慢回輸放出血液及林格氏液(量為全血量)，時間30 min。休克+引流組大鼠在維持低血壓1 h后，行腸淋巴管插管，引流休克腸淋巴液至液體復蘇結束后3 h;休克組僅行腹部手術，剝離腸淋巴管;假手術組僅麻醉、行股部、腹部手術，不放血及輸液。休克組與休克+引流組動物在輸液復蘇結束后3 h、假手術組在相應時點行腹主動脈插管取血(用于其它實驗)后，摘取大鼠脾臟，用于下述指標的檢測。

3 脾組織形態學觀察

選擇固定位置脾組織，以4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋，切片，蘇木精－伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，常規方法制備組織切片，光鏡下觀察脾臟組織學變化，并拍片。

4 脾組織細胞凋亡觀察

選擇固定位置留取脾組織，以4%多聚甲醛液固定4 h后，置30%蔗糖溶液中，待組織沉入容器底部，進行冰凍切片，切片厚3μm，貼片;PBS洗滌2次后，滴加Hoechst 33258染液，避光，5 min;PBS洗滌2次后，滴加抗淬滅封片液，封片;以激發波長350 nm，發射波長460 nm，于90-i多功能生物顯微鏡(Nikon)下觀察并采集圖像。

5 脾組織細胞凋亡相關基因的蛋白表達

取脾組織切片常規方法脫蠟水化、高壓抗原修復、PBS沖洗、滴加內源性過氧化物酶阻斷溶液(50 μL/片)、PBS 沖洗、滴加Ⅰ抗 Bcl-2(1∶100)/或 Bax(1∶100，均購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，4℃冰箱過夜，PBS沖洗后，加入過氧化物酶標記的Ⅱ抗37℃溫箱20 min，PBS洗滌3次、DAB顯色后，蘇木精復染25s，流水返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后觀察。每張片子隨機采集5個視野，采用麥克奧迪數碼醫學圖像分析軟件讀取灰度值，作為樣本Bcl-2/或Bax表達的半定量值。細胞染色呈棕黃色為陽性表達，灰度值越高，表達值越低。

6 脾組織細胞周期與增殖指數分析

將組織塊在200目的銅網上搓動，并同時用PBS向下沖洗細胞，離心收集細胞，經400目網過濾，PBS洗滌制成單細胞懸液，調整細胞數為1×106個，應用細胞周期分析試劑盒(BD)染色10 min，用FACSAria流式細胞儀(BD)進行檢測，ModFit軟件進行細胞周期分析，統計各時相細胞比例，計算PI:PI(%)=(S+G2M)/(G0G1+S+G2M)×100%。

7 脾組織細胞p53蛋白檢測

按前述方法制備單細胞樣品后，以4%多聚甲醛液固定0．5 h，0．0005%Triton X-100 處理2 min 以增加膜通透性，PBS洗滌細胞，調整細胞數為1×106個/管，每個樣本做雙管，一管加同型對照20μL，另一管加20μL p53-FITC(克隆號G59-12，同型對照克隆號MOPC-21，試劑盒購自BD)，孵育20 min后PBS洗細胞2次，加入1 mL PBS后應用流式細胞儀檢測，以p53陽性細胞所占百分率評價p53蛋白表達。

8 統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 16．0統計軟件包進行方差齊性檢驗，方差齊的資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，方差不齊的資料采用Kruskal-Wallis檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

結 果

1 腸淋巴液引流對失血性休克大鼠脾組織形態學的影響

假手術組大鼠脾組織表面包膜平滑，可見淋巴小結及“生發中心”，T、B淋巴細胞豐富而密集，脾索較粗，淋巴細胞密集，脾竇內較多組織細胞，無明顯組織學損傷，見圖1A。休克組淋巴小結增多，體積變小，未見“生發中心”，脾索變細，脾竇擴張，巨噬細胞增多，淋巴細胞增多，組織學損傷程度較重，見圖1B。與休克組脾組織學損傷的表現基本一致，休克+引流組淋巴小結體積較小，T、B淋巴細胞較稀疏，未見“生發中心”，脾小梁相對集中，脾索變細，脾竇擴張明顯，紅細胞呈“淤滯”狀態，細胞輪廓不清，組織學損傷程度較休克組輕，見圖1C。

Figure 1．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on pathological changes of spleen tissues in rats(HE staining，×100)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．圖1 休克腸淋巴液引流對大鼠脾組織形態學變化的影響

2 腸淋巴液引流對失血性休克大鼠脾組織細胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下可見:假手術組脾組織細胞核呈微弱均勻熒光，少見凋亡細胞，見圖2A;休克組細胞呈現較多凋亡細胞，由于染色質高度凝聚，致密濃染，或裂解成碎塊狀，染色呈強藍色熒光，紅髓、白髓和邊緣區都有分布，尤以白髓區為多，見圖2B;休克+引流組也有凋亡細胞，但較休克組少，見圖2C。

3 腸淋巴液引流對失血性休克大鼠脾組織細胞凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax表達的影響

大鼠脾組織細胞Bcl-2陽性表達定位于細胞核內，核膜陽性，呈顆粒狀，主要分布于脾臟的白髓部分;Bax陽性表達定位于細胞質，白髓和紅髓均有表達。休克組Bcl-2表達顯著低于假手術組(P＜0.01)，休克+引流組Bcl-2表達顯著高于休克組(P＜0．01)，見圖3;休克組Bax表達顯著高于假手術組(P＜0．01)，休克+引流組Bax表達顯著低于休克組(P ＜0．01)，見圖4。

Figure 2．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the apoptosis of splenocytes in rats(Hoechst 33258 staining，×400)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．圖2 休克腸淋巴液引流對大鼠脾組織細胞凋亡的影響

Figure 3．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on Bcl-2 expression in rat splenocytes(IHC staining，×400)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．Mean ±SD．n=6．＊＊P ＜0．01 vs sham;##P ＜0．01 vs shock．圖3 休克腸淋巴液引流對大鼠脾細胞Bcl-2表達的影響

Figure 4．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on Bax expression in rat splenocytes(IHC staining，×400)．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．Mean ±SD．n=6．＊＊P ＜0．01 vs sham;##P ＜0．01 vs shock．圖4 休克腸淋巴液引流對大鼠脾細胞Bax表達的影響

4 腸淋巴液引流對失血性休克大鼠脾細胞細胞周期與增殖指數的影響

與假手術組比較，休克+引流組G2/M期細胞明顯增多(P＜0.05)，其它各期無顯著差異(P＞0.05);與休克組比較，休克+引流組大鼠G0/G1期細胞降低(P＜0．01)、G2/M期和PI值顯著增多(P＜0．01)，見圖5、表 1。

Figure 5．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the cell cycle of splenocytes in rats．A:sham group;B:shock group;C:shock+drainage group．圖5 休克腸淋巴液引流對大鼠脾細胞細胞周期的影響

表1 休克腸淋巴液引流對大鼠脾細胞細胞周期與增殖指數的影響Table 1．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the cell cycle and proliferation index(PI)of splenocytes in rats(%．Mean±SD．n=6)

5 腸淋巴液引流對失血性休克大鼠脾組織細胞p53表達的影響

如圖6所示，休克組p53表達明顯強于假手術組(P＜0．01);休克+引流組大鼠脾細胞p53表達較休克組明顯降低(P＜0．01)，與假手術組無顯著差異。

討 論

免疫器官的結構、功能狀態與機體的免疫功能密切相關，免疫細胞增殖活躍或凋亡增多、或不協調性抑制均可引起機體免疫系統功能異常。研究發現，休克組大鼠脾臟出現了一定的組織學損傷，這與失血引起的缺氧、酸中毒使溶酶體膜的穩定性破壞、破裂而致溶酶釋放使大量淋巴細胞溶解等因素有關［10］，這可能是機體免疫功能紊亂的病理學基礎;休克腸淋巴液引流則減輕了脾組織學損傷的程度，這有利于從免疫器官角度調節機體的免疫平衡。此外，休克后脾組織出現了大量吞噬細胞，這對機體具有一定的代償意義。

Figure 6．Effects of post-shock mesenteric lymph drainage on the expression of p53 in rat splenocytes．Mean ±SD．n=6．＊＊P ＜0．01 vs sham;##P ＜0．01 vs shock．圖6 休克腸淋巴液引流對脾組織細胞p53表達的影響

為了進一步觀察腸淋巴液引流減輕脾損傷的作用機制，本研究觀察了腸淋巴液引流對脾臟組織細胞凋亡及相關蛋白表達、細胞周期與增殖指數的影響。結果顯示，休克組大鼠脾組織出現了大量的細胞凋亡，凋亡細胞大多聚集在細胞富集的白髓區，T細胞大量凋亡使機體細胞免疫功能受到抑制，這成為失控的全身炎性反應、膿毒癥發生的重要基礎［11］;細胞凋亡的發生與凋亡相關蛋白Bcl-2和Bax有關［12］，本文發現抑凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯降低，促凋亡蛋白Bax和p53表達上調，脾細胞增殖指數降低。有研究指出，p53在參與細胞周期調控的同時，發揮“分子警察”的功能，可抑制下游蛋白Bcl-2表達，從而促進細胞凋亡發生［13-15］。故本文結果表明，休克后脾組織T細胞凋亡的機制與這些因素有關。

行腸淋巴液引流則減少了大鼠脾臟細胞的過度凋亡，這對于調節機體免疫功能狀態是有利的;同時增加了Bcl-2蛋白表達，下調了Bax和p53蛋白表達，增加了脾細胞增殖指數，降低了G0/G1期細胞數，增加了G2/M期細胞數。這說明減少腸淋巴液回流有效、及時阻斷了凋亡信號轉導，使細胞凋亡維持在較低水平，從而發揮了對脾的保護作用。這與我室前期發現腸淋巴管結扎可減少二次打擊大鼠肺組織細胞凋亡［16］、休克腸淋巴液下調微血管內皮細胞促凋亡基因表達［17］、腸淋巴管結扎上調失血性休克大鼠肺組織促凋亡基因表達［18］的作用是一致的。

總之，失血性休克后大鼠免疫器官脾臟出現了組織損傷、凋亡細胞數目增多;腸淋巴液引流減輕了失血性休克大鼠的脾損傷，其機制與上調Bcl-2、下調Bax和p53蛋白表達從而減少細胞凋亡有關。以上結果提示，休克腸淋巴液在重癥休克后免疫功能紊亂的發病學中可能發揮重要作用。至于腸淋巴液引流對休克大鼠外周血T細胞亞群、細胞免疫功能的影響，還有待在以后的研究中進一步觀察。