紅花注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的兔彌散性血管內(nèi)凝血的作用*

朱瑋瑋， 李夢(mèng)佳， 馬蓮順， 劉 梅， 林 熙， 朱林燕， 肖 飛

(暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，廣東廣州510632)

彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)是由于某些致病因子的刺激，凝血因子和血小板被激活，大量促凝物質(zhì)進(jìn)入血液中，導(dǎo)致血管內(nèi)凝血酶增加，進(jìn)而使微循環(huán)形成廣泛的微血栓，同時(shí)或繼發(fā)纖溶亢進(jìn)，產(chǎn)生出血、休克、器官功能障礙和溶血性貧血等情況的一個(gè)病理過(guò)程［1］。DIC具有起病急驟、發(fā)展迅猛、預(yù)后兇險(xiǎn)、死亡率高的特點(diǎn)。由于DIC病因及病理生理過(guò)程復(fù)雜，目前缺乏安全有效的治療方法。臨床上主要采取的措施是在積極治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上采用抗凝、補(bǔ)充血小板及凝血因子、抑制纖溶、溶栓治療等，其中以肝素抗凝治療最為常用［2］。盡管肝素能在一定程度上抑制DIC的發(fā)展進(jìn)程，但存在較嚴(yán)重的副作用，尤其容易引起或加重患者出血。因此，迫切需要尋找一種安全有效、毒副作用低的方法治療DIC。

紅花注射液是由單味藥物紅花精制而成，主要成分為紅花黃色素。紅花是菊科植物紅花的管狀花，具有活血通絡(luò)，祛瘀止痛的功效［3］。有研究表明，紅花黃色素具有抗凝血和抑制血栓形成的作用:紅花黃色素B可抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)誘導(dǎo)的體外大鼠最大血小板聚集率，延長(zhǎng)大鼠離體血漿凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activeated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)［4］。以上證據(jù)提示，紅花對(duì)凝血系統(tǒng)有很強(qiáng)的抑制作用。因此，紅花注射液可能對(duì)DIC有良好的拮抗作用。

高凝期是DIC的發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要的一個(gè)時(shí)期，此期凝血系統(tǒng)被激活，凝血酶產(chǎn)生增多，血液中凝血酶含量增高，血液表現(xiàn)為高凝狀態(tài)，微循環(huán)中形成大量微血栓，易造成血管栓塞以及器官功能異常［1］。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的 DIC模型主要是模擬DIC的高凝期，本研究擬通過(guò)注射LPS建立家兔DIC模型，觀察家兔凝血系統(tǒng)相關(guān)指標(biāo)以及血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、血尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)的變化，從而證實(shí)紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)家兔DIC的拮抗作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康雄性新西蘭家兔60只，體重2．0～2．5 kg，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2008－0002。

2 試劑及儀器設(shè)備

紅花注射液購(gòu)于山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，每1 mL相當(dāng)于紅花原生藥0．5 g。LPS購(gòu)于Sigma;肝素購(gòu)于山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司;纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物［fibrin(ogen)degradation products，F(xiàn)DP］和 TNF-αELISA試劑盒購(gòu)于 BD Biosciences;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ(antithrombin III，ATⅢ)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海太陽(yáng)生物技術(shù)公司。Sysmex CA1500+CA6000全自動(dòng)凝血分析儀(Kobe);Sysmex SE-9500全自動(dòng)血細(xì)胞分析(Kobe);HITACHI 7170全自動(dòng)血漿分析儀(Hitachi)。

3 主要方法

3．1 動(dòng)物模型的建立 參照文獻(xiàn)［5-6］方法建立家兔DIC模型。從家兔耳緣靜脈按30 mg/kg注射3%戊巴比妥鈉麻醉，分離右側(cè)頸動(dòng)脈、插管，以備取血。LPS溶于60 mL生理鹽水中，然后從家兔耳緣靜脈以100 μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注，連續(xù) 6 h給藥，建立家兔DIC模型。給藥后2 h和4 h腹腔注射戊巴比妥鈉，維持動(dòng)物的持續(xù)麻醉狀態(tài)。

3．2 動(dòng)物分組 將家兔隨機(jī)分6組，每組10只:(1)正常對(duì)照組;(2)DIC模型組;(3)低劑量紅花注射液治療組;(4)中劑量紅花注射液治療組;(5)高劑量紅花注射液治療組;(6)肝素對(duì)照組。

3．3 給藥方法 (1)正常對(duì)照組:從家兔雙側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水(既不注射LPS，也不注射紅花注射液和肝素，連續(xù)6 h)。(2)DIC模型組:從家兔一側(cè)耳緣靜脈以100μg·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注LPS，同時(shí)從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以10 mL/h的速度滴注生理鹽水，連續(xù)6 h。(3)紅花注射液治療組:將紅花注射液溶于60 mL生理鹽水，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時(shí)，從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以1 mL·kg－1·h－1(低劑量)、3 mL·kg－1·h－1(中劑量)和10 mL·kg－1·h－1(高劑量)的速度滴注紅花注射液(10 mL/h)，連續(xù)6 h給藥。(4)肝素對(duì)照組:將肝素溶于60 mL生理鹽水中，從家兔一側(cè)耳緣靜脈滴注LPS的同時(shí)，從對(duì)側(cè)耳緣靜脈以6×105IU·kg－1·h－1(10 mL/h)的速度滴注肝素，連續(xù)6 h給藥。

3．4 觀察指標(biāo)和樣品的收集 在注射LPS前和注射2 h、6 h后分別從動(dòng)脈取血1 mL，置于含有1/10體積的枸櫞酸鈉抗凝液的塑料管中，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，待測(cè)血漿－20℃保存。用Sysmex CA1500+CA6000全自動(dòng)凝血分析儀檢測(cè)APTT、PT和纖維蛋白原含量;用Sysmex SE-9500全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板(platelet，PLT)計(jì)數(shù);用Hitachi 7170全自動(dòng)血漿分析儀測(cè)定血漿ALT活性和BUN含量;用發(fā)色底物法測(cè)定血漿蛋白C及ATⅢ的活性;ELISA試劑盒檢測(cè)血漿FDP和TNF-α含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行分析，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔死亡率的影響

給藥6小時(shí)后，DIC模型組家兔死亡數(shù)為5只，死亡率為50%;其余各組死亡數(shù)均為0只。與DIC組比較，各劑量紅花注射液組家兔死亡率均明顯下降(P ＜0．05)。

2 紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔凝血系統(tǒng)的影響

2．1 APTT和PT DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，APTT分別為(44.54±13.39)s和(98.62±24.51)s，與正常對(duì)照組［(19.69±1.97)s和(20.38±1.56)s］比較均明顯延長(zhǎng)(P＜0.05)，見(jiàn)表1;DIC模型組 PT值分別為(11.73±1.69)s和(20.54±5.83)s，與正常對(duì)照組［(6.37 ±0.94)s和(6.05±0.56)s］比較均明顯延長(zhǎng)(P ＜0.05)，見(jiàn)表1。用紅花注射液給藥2 h后，各劑量組APTT和中、高劑量組PT均明顯縮短(P＜0.05);給藥6 h后，各組APTT和PT都顯著縮短(P＜0.05)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥6 h后APTT和PT亦明顯縮短(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

2．2 血小板計(jì)數(shù) DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，血小板計(jì)數(shù)分別為(283．08±34．76)×109/L和(186．36 ±27．51)×109/L，與正常對(duì)照組［(407．35±28．27)×109/L 和(416．83 ±21．56)×109/L］相比顯著下降(P＜0．05)，見(jiàn)表1。注射紅花注射液2 h后，中、高劑量組血小板計(jì)數(shù)明顯升高;給藥6 h后，各組血小板計(jì)數(shù)都顯著升高。肝素組在給藥2 h后血小板計(jì)數(shù)明顯升高，給藥6 h后顯著升高(P＜0．05)，見(jiàn)表1。

2．3 纖維蛋白原含量 DIC模型組注射LPS 6 h后纖維蛋白原含量(1．78±0．36)g/L，與正常對(duì)照組［(4．67 ±0．81)g/L］相比明顯降低(P ＜0．05)，見(jiàn)表1。注射紅花注射液6 h各劑量組纖維蛋白原含量顯著升高(P＜0．05)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥6 h后纖維蛋白原含量明顯升高(P＜0．05)，見(jiàn)表1。

2．4 血漿FDP含量 DIC模型組注射LPS后FDP含量與正常對(duì)照組相比顯著升高(P＜0．05)，見(jiàn)表1。注射紅花注射液2 h后，中、高劑量組FDP含量明顯下降;6 h后各劑量組FDP含量均顯著下降(P＜0．05)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥后FDP含量顯著下降(P ＜0．05)，見(jiàn)表1。

2．5 血漿蛋白C和ATⅢ活性 DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后，血漿蛋白C水平分別為(67.97±17．68)% 和(41．09 ±16．19)%，與正常對(duì)照組［(94.63±5.46)%和(98.34±5.03)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1;ATⅢ的活性水平分別為(79.30±14.87)%和(57.63±12.06)%，與正常對(duì)照組［(97.72±3.87)%和(99.67±3.14)%］相比明顯降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1。注射紅花注射液6 h后，各組血漿蛋白C及ATⅢ活性水平均顯著升高(P＜0．05)，見(jiàn)表1。肝素組在給藥6 h后血漿蛋白C及ATⅢ活性明顯升高(P＜0．05)，見(jiàn)表1。

表1 紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔凝血系統(tǒng)的作用Table 1．Hemostatic parameters 2 h and 6 h after LPSinfusion into rabbits in different treatment groups(Mean±SD．n=10)

3 紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔血漿ALT及BUN的影響

DIC模型組注射LPS 2 h和6 h后血漿ALT及BUN均明顯升高(與正常對(duì)照組相比);注射紅花注射液2 h后，中、高劑量組血漿ALT活性與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05)，高劑量組血漿BUN含量與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05)，見(jiàn)圖1、2。注射紅花注射液6 h后，各組血漿ALT活性和BUN含量與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0.05)，見(jiàn)圖1、2。

Figure 1．Effect of Safflower injection on the plasma level of ALT in LPS-induced DIC rabbits．Mean ± SD．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．圖1 紅花注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的DIC兔血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響

Figure 2．Effect of Safflower injection on the level of BUNin LPS induced DIC rabbits．Mean ±SD．n=10．*P ＜0．05 vs DIC group．圖2 紅花注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的DIC兔血尿素氮的影響

4 紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的兔DIC纖維蛋白微血栓的影響

DIC模型組注射LPS后，腎小球毛細(xì)血管袢可見(jiàn)廣泛性微血栓伴毛細(xì)血管腔中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);低劑量紅花注射液組，腎小球毛細(xì)血管袢可見(jiàn)廣泛性微血栓伴毛細(xì)血管腔中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);中劑量紅花注射液組未見(jiàn)明顯微血栓，毛細(xì)血管腔見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);高劑量紅花注射液組未見(jiàn)明顯微血栓，見(jiàn)圖3。

5 紅花注射液對(duì)LPS誘導(dǎo)的DIC兔血漿TNF-α含量的影響

DIC模型組注射LPS1 h、4 h、8 h和12 h后血漿TNF-α含量明顯升高(與正常對(duì)照組相比);注射紅花注射液1 h后，高劑量組血漿TNF-α含量與DIC模型組相比明顯下降(P＜0．05);注射紅花注射液4 h、8 h和12 h后，各組血漿TNF-α含量與DIC模型組相比均明顯下降(P＜0．05)，見(jiàn)圖4。

討 論

DIC是一種由不同原因引起的、以全身性血管內(nèi)凝血系統(tǒng)激活為特征的獲得性綜合征。這種改變可來(lái)自并引起微血管系統(tǒng)的損害，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致器官功能衰竭［7］。在眾多引發(fā)DIC的原因中，感染性疾病是最為常見(jiàn)的一種。感染性DIC主要表現(xiàn)在凝血系統(tǒng)激活，大量凝血因子消耗，生成過(guò)量凝血酶，繼而在微循環(huán)內(nèi)形成血栓。LPS即內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的主要成分，其分子結(jié)構(gòu)由O特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質(zhì)A三部分組成。高濃度的LPS可激活補(bǔ)體替代途徑，引起發(fā)熱、低血壓，以及活化凝血系統(tǒng)，最后導(dǎo)致DIC［8］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靜脈持續(xù)滴注LPS誘導(dǎo)家兔DIC的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示APTT和PT呈進(jìn)行性延長(zhǎng)，血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量明顯降低;ALT和BUN明顯升高;蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性顯著降低;血清TNF-α含量顯著升高。這與Hermida等［9］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明已成功建立兔DIC模型。

反映凝血系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)主要有APTT、PT、纖維蛋白原含量、血小板計(jì)數(shù)、蛋白C含量、ATⅢ等。它們?cè)贒IC的過(guò)程中都起著非常重要的作用。APTT能反映血漿凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ水平，是評(píng)價(jià)內(nèi)源凝血系統(tǒng)較為敏感和最常用的指標(biāo)。PT是用于檢測(cè)外源性凝血途徑、維生素K依賴性凝血因子缺陷以及存在相關(guān)因子抑制物的過(guò)篩實(shí)驗(yàn)。它反映凝血因子Ⅰ、Ⅱ、V、Ⅶ和X的含量或循環(huán)抗凝物質(zhì)的存在［10］。血小板是止血及凝血中所需的一種極其重要的物質(zhì)，血小板活化后，不僅依賴本身的黏附與聚集功能而形成白色血栓，更通過(guò)其促凝作用加強(qiáng)血凝，促使纖維蛋白原轉(zhuǎn)為纖維蛋白，加重、加速DIC的發(fā)生發(fā)展。纖維蛋白原即凝血因子Ⅰ，是血漿中含量最高的凝血因子［11］。FDP對(duì)凝血酶具有明顯的抑制作用，能與纖維蛋白原以及纖維蛋白單體形成可溶性復(fù)合物，從而抑制纖維蛋白的形成［11］。蛋白C是人體內(nèi)一種重要的抗凝因子，其以無(wú)活性的酶原形式存在于血漿中，可在凝血酶作用下轉(zhuǎn)變

為活化蛋白C(activeated protein C，APC)，發(fā)揮以下作用:(1)滅活凝血因子Ⅴa和Ⅷa;(2)抑制纖溶酶原激活劑抑制物(PAI)組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，從而激活纖溶系統(tǒng);(3)抑制凝血因子Ⅹa、Ⅴa與血小板膜磷脂的結(jié)合;(4)加強(qiáng)ATⅢ-凝血酶復(fù)合物的結(jié)合。ATⅢ是一種多功能的絲氨酸蛋白酶抑制劑，對(duì)以絲氨酸為活性中心的被激活的凝血因子(Ⅸa、Ⅹa、Ⅺa、Ⅻa、Ⅶa)、凝血酶以及蛋白酶(纖溶酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶)都有抑制作用，它對(duì)因子Ⅹa的抑制作用大于凝血酶［12］。與DIC模型組相比，用紅花注射液給藥后各組APTT和PT都明顯縮短、FDP含量明顯降低、纖維蛋白原含量和血小板計(jì)數(shù)都明顯升高、蛋白C和ATⅢ進(jìn)行性升高。由此表明紅花注射液可以減輕DIC所致的凝血反應(yīng)、減少凝血物質(zhì)的消耗、增強(qiáng)抗凝物質(zhì)的作用，并且通過(guò)同時(shí)抑制內(nèi)源性、外源性凝血通路從而發(fā)揮抗凝血作用。

Figure 3．Effect of Safflower injection on the formation of fibrin microthrombi in LPS-induced DIC rabbits(fibrin staining，×400)．圖3 紅花注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的DIC兔纖維蛋白微血栓的影響

BUN和ALT是評(píng)價(jià)肝腎功能的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)。當(dāng)BUN升高時(shí)，提示腎實(shí)質(zhì)受到損害;當(dāng)ALT升高時(shí)，提示肝細(xì)胞受到損害。紅花注射液使LPS所誘導(dǎo)的DIC兔的ALT和BUN顯著下降，提示紅花注射液可以在LPS誘導(dǎo)的兔DIC發(fā)生時(shí)保護(hù)肝、腎等重要器官的功能。其作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

炎癥介質(zhì)的釋放是DIC發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分，各種促炎介質(zhì)通過(guò)活化內(nèi)皮細(xì)胞、促進(jìn)凝血及補(bǔ)體活化等作用使機(jī)體產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致DIC的發(fā)生［13］。有研究表明，TNF-α可明顯增加組織因子的表達(dá)和活性，而TF是外源性凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)子，TF表達(dá)增加可引起凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)血栓形成及DIC［13-14］。與DIC模型組相比，用紅花注射液所治療3組的血漿TNF-α含量都明顯下降。從而提示紅花注射液可以通過(guò)降低促炎因子的水平來(lái)起到對(duì)LPS所致的兔DIC的拮抗作用。

綜合上述，在LPS所致的兔DIC模型中，紅花注射液可以明顯降低DIC兔的死亡率，顯著縮短APTT和PT，明顯升高血小板計(jì)數(shù)和纖維蛋白原含量，顯著增強(qiáng)蛋白C和抗凝血酶Ⅲ的活性，有效降低FDP、ALT、BUN和TNF-α水平。這可能是與紅花注射液可以減少炎癥介質(zhì)的表達(dá)、減少凝血物質(zhì)消耗、促進(jìn)抗凝系統(tǒng)激活以及抑制凝血系統(tǒng)的發(fā)展有關(guān)。同時(shí)，紅花注射液可以減少肝腎等重要臟器在LPS誘導(dǎo)的DIC發(fā)生時(shí)的損傷。由此表明紅花注射液對(duì)LPS所致的DIC有明顯的拮抗作用，為今后DIC的預(yù)防與早期治療提供了新的途徑。