IL－1βmRNA在腦梗塞大鼠腦組織表達(dá)及針?biāo)幗Y(jié)合治療后的免疫干預(yù)機(jī)制*

顏培宇，王亞賢，于曉紅，代巧妹

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040)

腦梗塞是我國中老年人的常見病、多發(fā)病，具有致殘率高、死亡率高等臨床特點。近年來的研究表明，腦梗塞發(fā)生的病理過程中存在炎癥和免疫反應(yīng)，致炎因子(IL－1β)在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，參與了腦組織的損傷和細(xì)胞凋亡過程。筆者運(yùn)用針?biāo)幗Y(jié)合的方法研究腦梗塞大鼠的腦組織IL－1βmRNA表達(dá)情況，并與單純電針和單純中藥組進(jìn)行了比較，現(xiàn)將結(jié)果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康Wistar大鼠120只，體重280～350 g，雌雄各半。由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號:scxk(京)2007－0001。

1.2 藥物與試劑

中藥活腦康(丹參12 g，赤芍、五靈脂、雞血藤、羌活、生地黃各9 g，甘草15 g)為黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥廠產(chǎn)品;Real Time PCR(HaiGene，SYBR Green熒光定量試劑盒)由上海西唐生物科技有限公司提供);引物合成及相關(guān)試劑由海基生物技術(shù)公司提供。

1.3 主要儀器

電針儀(G6805－2型，廣東省汕頭市醫(yī)用設(shè)備廠);熒光定量 PCR 儀(ABI7500，ABI Corp，USA);Biometra－T PCR 儀(Biometra Corp.Genm)。

1.4 分組與造模方法

將大鼠隨機(jī)分為5組，每組6只。即正常對照組(A)、模型組(B)、中藥活腦康組(C)、電針組(D)和中藥活腦康配合電針聯(lián)合治療組(E);C～E組根據(jù)治療時間分為2 d、4 d、6 d和8 d組。B～E組采用Longa的腔內(nèi)線栓法［1］阻滯大鼠右側(cè)大腦中動脈，復(fù)制腦梗塞模型。造模后動物在自然蘇醒后，選取出現(xiàn)右側(cè)Honer征(提尾左前肢內(nèi)收屈曲，爬行時向左側(cè)劃圈)的大鼠。

1.5 治療方法

1.5.1 選穴及定位 選取“百會”及“大椎”兩穴，取穴定位參照“十一五”國家規(guī)劃教材《實驗針灸學(xué)》［2］和《經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)》［3］大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖定位及擬人對照法定位。

1.5.2 治療方案 ①A組和B組每日給予生理鹽水(6 g/kg)灌胃及綁縛固定;②C組于造模成功24 h后給予活腦康5 ml/支，含藥量1.5 g，灌胃治療，6 g/kg，每日一次;③D組于造模成功24 h后給予電針治療，連續(xù)波，頻率20 Hz，強(qiáng)度 1 ～2 mA，持續(xù) 30 min，每日一次;④E組于造模成功24 h后給予活腦康灌胃后進(jìn)行電針治療(同D、E組)，每日一次。

1.6 指標(biāo)測定

各組實驗大鼠分別于治療2 d、4 d、6 d和8 d后，無菌取腦組織，迅速投入液氮中保存。采用RT－PCR法測定各組大鼠腦組織IL－1βmRNA表達(dá)情況。

1.6.1 引物 IL－1β 上游引物5'－ATAGCGTGACATTAAGAG－3';下游引物5'－GTGACGATAGTGATGACCT－3';βactin上游引物5'－ATCCCAAACAATACCCA－3';下游引物5'－CAACTATGTCCCGACCA－3'。

1.6.2 大鼠腦組織總RNA提取 ①組織于液氮條件下研磨粉碎，取100 mg裝入1.5 ml EP管中;②向每管中加入1 ml的Trizol Reagent;③用移液槍反復(fù)吹吸直至裂解液中無明顯沉淀，室溫靜置5 min;④向上述裂解液中加入200 μl氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩15 s，待充分乳化溶液呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后，室溫靜置5 min;⑤12 000 g 4℃離心15 min;⑥從離心機(jī)中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機(jī)相，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中;⑦向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后20℃室溫靜置10 min，12 000 g 4℃離心10 min;⑧小心棄去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇1 ml(切勿觸及沉淀)，輕輕上下顛倒洗滌離心管管壁。2～8℃12 000×g離心5 min，棄上清;⑨室溫干燥沉淀5 min，加入100 μl無RNase的水，55～60℃放置10 min完成RNA提取。

1.6.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(HaiGene，cDNA第一鏈合成試劑盒) 在PCR管中配制混合液，在PCR儀上進(jìn)行以下反應(yīng):65℃，5 min，然后置于冰上急冷。在PCR管中加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，在PCR儀上按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):30℃10 min，42℃30 ～ 60 min，95℃5 min，4℃。定量PCR儀:beta－actin標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，樣品5倍稀釋，即為1、5、25、125 copy 數(shù)，擴(kuò)增結(jié)果良好。β － actin溶解曲線制作，結(jié)果良好。P標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，結(jié)果良好。樣品5倍稀釋，即為1、5、25、125 copy數(shù)，擴(kuò)增結(jié)果正常。SP溶解曲線制作，結(jié)果良好。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

在腦梗塞造模后2 d，腦組織明顯表達(dá) IL－1βmRNA，4～8 d后，IL－1βmRNA 依然維持較高水平，與正常對照組比較有非常顯著性差異(P＜0.01);治療2天后，與模型組比較，電針組和針?biāo)幗Y(jié)合組大鼠IL－1βmRNA表達(dá)明顯下降，與模型組比較有非常顯著性差異(P＜0.01);治療4 d后，各治療組大鼠IL－1βmRNA表達(dá)均明顯下降，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.01)。針?biāo)幗Y(jié)合組療效顯著，且維持到治療6 d和8 d后，與單純電針組和單純中藥組比較差異有顯著性(P＜0.05)。電針組和中藥組比較無顯著性差異(P ＞0.05)。見表1。

表1 針?biāo)幗Y(jié)合對腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達(dá)的影響(±s)

表1 針?biāo)幗Y(jié)合對腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達(dá)的影響(±s)

注:與模型組比較，*P＜0.01;與模型組和中藥組比較，＊＊P＜0.05;與電針組和中藥組比較，▲P ＜0.05;與中藥組比較，＊▲P ＞0.05。

組別n 治療后不同時間點IL－1βmRNA 表達(dá)量2 d 4 d 6 d 8 d正常對照組 6 0.91 ±0.18* 0.79 ±0.11*0.87 ±0.16*0.84 ±0.14*模型組 6 2.22 ±0.08 2.11 ±0.07 2.04 ±0.08 2.02 ±0.13電針組 6 1.68 ±0.31＊＊1.89 ±0.16 1.75 ±0.14 1.46 ±0.22＊▲中藥活腦康組 6 2.21 ±0.09 1.61 ±0.25 1.61 ±0.24 1.30 ±0.25電針配合中藥活腦康組6 1.35 ±0.26＊＊1.15 ±0.16 1.14 ±0.12 0.77 ±0.09▲

3 討論

腦梗塞是嚴(yán)重危害人類健康的一種常見病、多發(fā)病。梗死后炎癥反應(yīng)是神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要原因［4］。IL－1是一種前炎性細(xì)胞因子，可在健康大鼠腦皮質(zhì)、海馬部位低水平表達(dá)［5］，當(dāng)腦梗發(fā)生后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL－1增加，形成局部炎癥，引發(fā)神經(jīng)組織細(xì)胞損傷和死亡，加重腦部炎性反應(yīng)和水腫，引起一系列病理過程［6］。在一系列炎性因子中，IL－1β與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［7］。近期研究發(fā)現(xiàn)，致炎因子(IL－1)等可激活局部血管內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞大量的牢固黏附，導(dǎo)致微血管阻塞，從而加重腦細(xì)胞損傷。近年來，人們對腦梗死的臨床治療進(jìn)行了大量的研究［8－10］，針?biāo)幗Y(jié)合不失為協(xié)同增效的更好方法。本項研究旨在前人研究的基礎(chǔ)上，探索針?biāo)幗Y(jié)合的有效治療機(jī)制，尤其是這一傳統(tǒng)的治療方法對機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為臨床治療和基礎(chǔ)研究工作提供更新的數(shù)據(jù)，為針?biāo)幗Y(jié)合的推廣使用奠定基礎(chǔ)。

中藥活腦康是本院藥廠自主研發(fā)的復(fù)方，在臨床用于治療腦梗塞患者，取得了滿意的療效。主要由丹參、赤芍、五靈脂、雞血藤、羌活、生地黃和甘草等中藥組成，配合電針治療腦梗塞患者療效顯著。為了研究其臨床有效性的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，本課題組申報了這一項目，開展了相關(guān)研究工作。實驗結(jié)果表明，中藥活腦康對腦梗塞大鼠免疫途徑的干預(yù)作用，表現(xiàn)在中藥活腦康組與模型組比較，在治療4 d后IL－1βmRNA表達(dá)降低;在治療6 d和8 d后IL－1βmRNA表達(dá)持續(xù)降低。表明中藥活腦康可抑制腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達(dá)，對腦損傷有一定的保護(hù)作用。電針腦梗塞大鼠免疫途徑的干預(yù)作用，表現(xiàn)在電針組與模型組比較，治療2 d后IL－1βmRNA表達(dá)即降低;在治療4 d、6 d和8 d后IL－1βmRNA表達(dá)雖降低，但與針?biāo)幗Y(jié)合組比較療效不顯著。表明電針可在早期抑制腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達(dá)，對腦損傷有一定的保護(hù)作用，但有時間窗效應(yīng)。電針配合中藥活腦康組(針?biāo)幗Y(jié)合組)對腦梗塞大鼠免疫途徑的干預(yù)作用，表現(xiàn)在與模型組比較，在治療4 d后IL－1βmRNA表達(dá)明顯降低;在治療6 d和8 d后IL－1βmRNA表達(dá)持續(xù)降低，療效優(yōu)于單純電針組和單純中藥活腦康組。表明針?biāo)幗Y(jié)合的治療方法可持續(xù)抑制腦梗塞大鼠腦組織IL－1βmRNA表達(dá)，對腦損傷有一定的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

腦梗塞大鼠腦組織內(nèi)IL－1βmRNA表達(dá)顯著升高，電針在治療早期效果顯著，針?biāo)幗Y(jié)合方法可在治療中后期維持這種治療作用，進(jìn)而控制炎性損傷，促進(jìn)腦組織修復(fù)，隨著治療時間的延長，這種優(yōu)勢更加明顯。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，CarlsonS，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(1):84－91

［2］余曙光，徐斌.實驗針灸學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2012:272

［3］沈雪勇.經(jīng)絡(luò)腧穴學(xué)［M］.2版.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2012:217－220

［4］陳衛(wèi)銀，孫承銘，王會民，等.丹參酮IIA預(yù)處理對局灶性腦缺血模型大鼠IL－1β，RelAmRNA表達(dá)的影響［J］.南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，30(9):2115 －2118

［5］VitkovicL，Bockaertj Jacquec.Inflammatory cytokines:neuromodulators in normal brain［J］.J.Neurochem，2000，74(2)457 －471

［6］胡小令，呂誠，楊寶林，等.雷公藤內(nèi)酯醇對大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)注射Aβ后IL－12和IL－1β表達(dá)的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2011，31(20):3952－3955

［7］黃艷玲，張敏，余宏.馬來酸桂哌齊特對急性腦梗死患者血清IL－1β，IL－6及神經(jīng)功能缺損程度的影響［J］.重慶醫(yī)學(xué).2011，40(25):2532－2536

［8］孟令盤.通心絡(luò)對急性腦梗死患者血清IL－1、IL－6水平影響的臨床研究［J］.中醫(yī)臨床雜志，2012，vol(3):42－44

［9］張琪，陳曉光，楊春曉，等.核轉(zhuǎn)錄因子kB抑制劑緩解大鼠局部腦缺血后腦損傷［J］.中華老年心腦血管病雜志，2010，12(8):748－750

［10］余茜，李曉紅，黃林，等.電針對腦梗死大鼠行為能力及海馬CA1區(qū)凋亡相關(guān)基因B細(xì)胞淋巴瘤/白血病基因－2、細(xì)胞凋亡通路蛋白X表達(dá)的影響［J］.中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2012，34(4):245－249