雷帕霉素與大鼠肝纖維化演變的相關(guān)研究

鐘志宏，戴 東，陳土明，吳祖超

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 肝膽外科，廣東 湛江524001）

轉(zhuǎn)化生長因子（TGF－β1）是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF－β超家族，研究顯示TGF－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。本實驗選擇大鼠肝纖維化模型，應(yīng)用mTOR受體抑制劑雷帕霉素（RAPA）治療，觀察其對大鼠肝臟TGF－β1的表達(dá)及雷帕霉素對肝纖維化的影響，探討雷帕霉素在肝纖維化演變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型的制備 成年健康雄性SD大鼠24只，體重200－250g，由廣東醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。按四氯化碳油（CCl4油）誘導(dǎo)建立大鼠肝纖維化模型。

1.2 實驗方法 24只SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組（A組）、肝纖維化模型組（B組）、雷帕霉素組（C組）每組8只。B、C組建立模型；C組按雷帕霉素2mg／kg體重胃內(nèi)灌灌注，每天1次，持續(xù)2周。A、B組按同劑量予生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)2周。同期處死取肝臟組織切片，對肝組織切片分別行HE染色及免疫組織化學(xué)法處理，相片用Imagepro plus 6.0圖像分析軟件處理。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較采用獨立樣本的t檢驗。實驗各組間比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）

2 結(jié)果

2.1 HE染色對肝臟組織的變化 見圖1。

2.2 雷帕霉素對肝臟TGF－β1表達(dá) 見圖2，表1。

圖1 HE染色對肝臟組織的變化

圖2 雷帕霉素對肝臟TGF－β1表達(dá)

表1 大鼠肝臟組織TGF－β1的陽性表達(dá)

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，TGF－β1可促進(jìn)肝纖維化，通過TGF／Smad信號通路進(jìn)行調(diào)控ECM的沉積，TGF－β1的大量表達(dá)，促使ECM過度沉積，加速肝纖維化。在肝硬化形成過程中抑制、緩解及延緩病程發(fā)展是基礎(chǔ)與臨床研究的重點。本實驗病理HE染色及免疫組織化學(xué)結(jié)果觀察到，模型組中肝纖維化明顯，纖維間隔穿插其中；應(yīng)用雷帕霉素2周后，TGF－β1表達(dá)明顯下降，纖維間隔程度也較模型組減少。結(jié)果顯示，雷帕霉素可抑制纖維肝大鼠肝組織中TGF－β1表達(dá)。TGF－β在正常肝臟組織中轉(zhuǎn)錄水平很低，而在肝纖維化模型中，在大多數(shù)的間充質(zhì)細(xì)胞、單核細(xì)胞、肝細(xì)胞中TGF－βRNA轉(zhuǎn)錄處于高水平，TGF－β家族中尤以TGF－β1在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中有著重要的作用［1］。相關(guān)資料對HSC凋亡的調(diào)節(jié)因子主要有抑制HSC凋亡的生長因子如TNF－α、TGF－β、IFN－α、leptin 等［2］，而細(xì)胞因子中只有TGF－β能刺激HSC合成膠原纖維，而其他細(xì)胞因子僅刺激HSC增殖［3］，TGF－β通過TGF／Smad信號通路進(jìn)行調(diào)控ECM的沉積。在肝纖維化進(jìn)展期中，Kupffer Cell（KC）通過自分泌或旁分泌途徑分泌大量TGF－β1，同時增加HSC上血小板衍生因子（PDGF）受體表達(dá)，通過自分泌循環(huán)分泌TGF－β1和PDGF，使HSC持續(xù)活化，抑制其凋亡。大鼠星狀細(xì)胞體外培養(yǎng)活化后形態(tài)類似成纖維細(xì)胞，有研究者認(rèn)為，HSC是成纖維細(xì)胞前體，在肝損傷時HSC活化轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細(xì)胞，分泌ECM、細(xì)胞因子和蛋白酶抑制劑等成分參與肝纖維化進(jìn)展［4］。雷帕霉素改善肝纖維化，與多途徑調(diào)控TGF－β1表達(dá)相關(guān)。RAPA作為PI3K／AKT／mTOR信號通路抑制劑，抑制其激酶活性，阻斷其細(xì)胞通路，抑制下游S6K1和4EBP1的磷酸化，從而抑制細(xì)胞分化和增殖［5－7］。KC作為肝臟固定于肝竇竇壁的巨噬細(xì)胞，RAPA阻斷 巨噬細(xì)胞的PI3K／AKT／mTOR通路，減少細(xì)胞因子如 TNF－α、TGF－β1等的釋放，抑制HSC增殖活化，促進(jìn)HSC的凋亡，減少HSC轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，使ECM沉積減輕。單側(cè)輸尿管梗阻的老鼠模型中，通過封閉mTOR信號通路，抑制巨噬細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，可以有效的改善患側(cè)腎臟的纖維化［8］。RAPA也可以直接作用于HSC的Fas／Fasl系統(tǒng)，抑制細(xì)胞周期凋亡相關(guān)基因Bcl－2的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)Fas／FasL系統(tǒng)中的重要因子Fas的表達(dá)，同時促進(jìn)凋亡基因P53表達(dá)增多，啟動Fas／FasL凋亡通路，上調(diào)P53、下調(diào)Bcl－2的表達(dá)實現(xiàn)HSC凋亡，抑制增殖［9，10］，減少 ECM 的沉積。本實驗通過應(yīng)用mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素，檢測大鼠肝臟組織的病理形態(tài)改變及TGF－β1的表達(dá)，探討雷帕霉素在肝纖維化進(jìn)展中相關(guān)作用，實驗結(jié)果顯示：應(yīng)用雷帕霉素大鼠，肝組織TGF－β1的表達(dá)明顯降低，肝臟組織纖維化得以改善。

［1］Milani S，Herbst H，Schuppan D，et al.Transforming growth factors beta 1and beta 2are differentially expressed in fibrotic liver disease［J］.Am J Pathol，1991，139（6）：1221.

［2］Friedman S L.Mac the knife？Macrophages—the double－edgedsword of hepatic fibrosis［J］.J Clin Invest，2005，115（1）：29.

［3］Shek F W，Benyon R C.How can transforming growth factor beta be targeted usefully to combat liver fibrosis［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2004，16：123.

［4］Guyot C，Lepreux S，Combe C，Doudnikoff E，et al.Hepatic fibrosis and cirrhosis：the （myo）fibroblastic cell subpopulations involved［J］.Int J Biochem Cell Bio，2006，38：135.

［5］Gao N，F(xiàn)lynn DC，Zhang Z，et al.G1cell cycle progression and the expression of G1cyclins are regulated by PI3K／AKT／mTOR／p70S6K1signaling in human ovarian cancer cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2004，287（2）：C281.

［6］Gai B，Zhang Z，Jiang BH，et al.Role of PI3K／AKT／mTOR signaling in the cell cycle progression of human prostate cancer［J］.Biochem Biophys Res Commun，2003，310（4）：1124.

［7］Xu Z，Zhang Y，Jiang J，Yang Y，et al.Epidermal growth factor induces HCCR expression via PI3K／Akt／mTOR signaling in PANC－1pancreatic cancer cells［J］.BMC Cancer，2010，10：161.

［8］Chen G，Chen H，Wang C，et al.Rapamycin ameliorates kidney fibrosis by inhibiting the activation of mTOR signaling in interstitial macrophages and myofibroblasts［J］.PLoS One，2012，7（3）：e33626.

［9］翁山耕，徐常國，孫 穎，等.雷帕霉素誘導(dǎo)大鼠肝形狀細(xì)胞凋亡的研究［J］.臨床肝膽病雜志，2012，28（3）：219.

［10］Shafer A，Zhou C，Gehrig PA，et al.Rapamycin potenciates the effects of paclitaxel in endometrial cancer cells through inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis［J］.Int J Cancer，2010，126（5）：1144.