重組人腦利鈉肽對動脈硬化大鼠血管內皮功能的影響

周 琳，張 靜，袁天陽，李揚雪，徐艷玲，戴 琎

（吉林大學第二醫院 心血管內科，吉林 長春130041）

動脈粥樣硬化（AS）其主要病變特點是動脈病變從血管內膜開始，局部有脂質和復合糖類聚集，出血和血栓形成，纖維組織增生和鈣鹽沉積，并有中層的逐漸退化及鈣化。但其發病機制尚無定論，目前較為接受的學說是血管內皮細胞損傷的反應假說。當內皮功能障礙時可導致血管收縮、血栓形成、內膜增生等。因此保護血管內皮功能成為治療動脈粥樣硬化的新趨勢。

1 材料與方法

1.1 材料

40只健康Wistar大鼠購自吉林大學白求恩醫學部實驗動物中心。重組人腦利鈉肽 （新活素），由成都諾迪康生物制藥有限公司提供，單硝酸異山梨酯（華仁欣舒），由青島華仁藥業提供，阿魏酸鈉（海斯），由晉城海斯制藥有限公司提供。高脂飼料（普通面料88.8%，由吉林大學公共衛生學院提供；豬油10%，由吉林大學公共衛生學院提供；膽固醇1%，由沈陽試劑五廠提供；豬膽鹽0.2%，由中國惠氏生化試劑有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 動脈粥樣硬化模型的建立和動物分組 40只健康 Wistar大鼠，均為雄性，體重為（220±10）g，實驗室保持室內安靜，飼養溫度（22±2）℃，相對濕度40%－50%，通風良好，自然光照，光－暗周期12 h，自由進普通飼料、水，實驗前適應1周后按體重質量隨機分成5組，對照組、模型組、硝酸酯處理組、阿魏酸鈉處理組及新活素處理組各8只。除對照組繼續喂養普通飼料外，余4組給予維生素D3灌胃（按5×105U／kg的總量分3天灌胃），其后飼以高脂飲食。實驗周期為12周。

1.2.2 給藥途徑 硝酸酯處理組：給予皮下注射單硝酸異山梨酯3mg／kg每日一次，阿魏酸鈉處理組：給藥劑量（mg／kg）＝W×人注射劑量（mg／kg）。（人靜點阿魏酸鈉劑量按400mg／60kg／d，W為折算系數取6.25），每日皮下注射一次。新活素處理組：給予rhBNP 0.1mg／kg每日一次皮下注射。對照組，模型組均給予等劑量的生理鹽水。

1.2.3 生化指標測定 采用全自動生化分析儀測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）水平。

1.2.4 TXB2、6－Keto－PGF1a的測定 5組分別在處理前及處理后抽血4ml，3 500r／min離心15 min，分離出血清，－80℃冰箱保存。所有標本與收集后統一檢測。分別采用酶聯免疫法（ELISA）檢測各組用藥前后血清中 TXB2、6－Keto－PGF1a濃度。

1.2.5 主動脈切片的制備 用乙醚麻醉動物，心臟取血后，立即取完整主動脈（從主動脈根部至髂總動脈分叉處），經10%甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋，切片二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗，蘇木紫染色5min，鹽酸乙醇化30s，自來水浸泡15min后，置伊紅液2min，常規脫水、透明、封片。

1.2.6 統計學方法 所有數據均采用SPSS11.0統計軟件進行統計分析。各組參數用±s表示，同組藥物處理前后比較采用配對樣本均數的t檢驗。檢驗水準α＝0.05，P＞0.05差異無統計學意義，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠體重的變化（表1）：12周后，高脂飼料組與對照組比較體重有明顯差異P＜0.05。

表1 各組間大鼠體重的比較（±s）（單位：g）

表1 各組間大鼠體重的比較（±s）（單位：g）

注：＊各組與對照組比較無明顯差異，P＞0.05；#各組與對照組比較有顯著性差異，P＜0.05

n第1周 第4周 第8周 第12周18模型組 8 244.50±6.0＊ 384.1±8.37# 423.0±6.87# 455.0±13.8#硝酸酯組 8 247.50±9.0＊ 385.0±4.08# 427.5±6.29# 460.0±12.9#阿魏酸鈉組 8 247.23±10.53＊ 387.5±6.92# 431.6±7.45# 461.0±12.1#新活素組 8 247.00±13.52＊ 388.3±7.45# 430.0±6.45# 458.0±15.7對照組 8 243.10±8.8 363.3±7.08 393.0±5.77 413.0±7.#

2.2 各組血脂及相關成分的濃度的變化（表2）：高脂飲食組血脂水平明顯高于對照組（P＜0.05），各處理組之間血脂水平未見明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組間大鼠血脂及相關指標的結果（±s）（mmol／L）

表2 各組間大鼠血脂及相關指標的結果（±s）（mmol／L）

注：#各組與對照組比較有顯著差異，P＜0.05；＊處理組之間比較未見明顯改變，P＞0.05

8 3.6±0.42 1.68±0.18 2.02±0.05 2.84±0.23模型組 8 13.0±0.47# 5.89±0.40# 1.39±0.26# 3.92±0.18#硝酸酯組 8 13.7±0.92#＊ 5.92±0.29#＊ 1.39±0.21#＊ 3.93±0.10#＊阿魏酸鈉組 8 14.3±0.72#＊ 5.93±0.20#＊ 1.34±0.15#＊ 3.92±0.16#＊新活素組 8 14.4±0.46#＊ 5.94±0.16#＊ 1.41±0.16#＊ 3.93±0.14#＊TC TG HDL－C LDL－C對照組n

2.3 大鼠主動脈形態學變化

2.3.1 肉眼觀察情況

對照組血管彈性較好，內膜光滑，富有光澤。高脂組：動脈彈性減低，管壁增厚，內膜光澤度較對照組差。各處理組之間肉眼觀察較模型組無明顯改變。

2.3.2 光鏡觀察結果 光鏡觀察提示（×100倍）：對照組中大鼠主動脈內膜血管內皮排列有序，未見異常改變。模型組中大鼠主動脈血管壁局部形成粥樣斑塊向管腔內突出，引起管腔狹窄，斑塊由泡沫細胞和膽固醇結晶構成，彈力纖維斷裂，動脈外膜變薄，呈現較典型的動脈粥樣硬化改變。光鏡觀察提示（×200倍）：對照組主動脈EC排列有序，無明顯改變。模型組中可見血管內膜不光滑，局部可見泡沫細胞和膽固醇結晶。

進一步放大（×400倍）觀察提示：對照組動脈內膜光滑，EC排列整齊有序、無缺失，內膜下間隙較小；模型組血管壁增厚，內膜不光滑，排列紊亂，EC成連續性缺失，底層膠原纖維暴露，大量MC粘附于內皮表面或潛入內皮下，內皮下間隙增寬；處理組內膜較光滑，局部有少量MC粘附，可見EC缺失，但好于模型組，處理組之間未見明顯差別。（見圖1－12）

圖1 模型組主動脈組織HE染色×100

圖2 正常對照組主動脈組織HE染色×100

圖3 模型組主動脈組織HE×200

圖4 正常對照組主動脈組織HE×200

圖5 硝酸酯處理組主動脈組織HE×200

圖6 阿魏酸鈉處理組主動脈組織HE×200

圖7 新活素處理組主動脈組織HE×200

圖8 模型組主動脈組織HE×400

圖9 正常對照組主動脈組織HE×400

圖10 硝酸酯處理組主動脈組織HE×400

圖11 阿魏酸鈉處理組主動脈組織HE×400

圖12 新活素處理組主動脈組織HE×400

2.4 處理組前后TXB2和6－Keto－PGF1a變化的比較（±s）

處理組在處理前的TXB2和6－Keto－PGF1a之間組間比較，差別無統計學意義（P＞0.05），但是其與對照組比較，差別有統計學意義（P＜0.05）。各處理組治療前后TXB2和6－Keto－PGF1a比較差異有統計學意義（P＜0.05），處理后好于處理前。見表3。

表3 處理前后大鼠TXB2和6－Keto－PGF1a變化的比較（±s）

表3 處理前后大鼠TXB2和6－Keto－PGF1a變化的比較（±s）

注：＊各組處理前比較無統計學差異P＞0.05，# 每組與處理前比較有統計學差異（P＜0.05）

TXB 2 6－Keto－PGF1 n α 8 100.5±3.77 100.4±3.36 61.6±3.35 61.8±2.32模型組 8 150.5±3.98＊ 152.6±3.94 48.7±1.93＊ 49.4±1.40#硝酸酯組 8 150.5±2.62＊ 136.2±2.0# 47.7±2.24＊ 63.0±2.23#阿魏酸鈉組 8 150.4±4.74＊ 123.7±1.5# 50.1±2.41＊ 72.89±2.09#新活素組 8 151.5±5.31＊ 114.0±1.7# 50.41±2.28＊ 83.61±1.30處理前 處理后對照組處理前 處理后#

2.5 不同藥物對TXB2、6－Keto－PGF1a處理后結果的比較（±s）

硝酸酯類、阿魏酸鈉、新活素處理后TXB2、6－Keto－PGF1a在各組略有不同，新活素組不劣于硝酸酯組及阿魏酸鈉組，但無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

從本研究結果得到：rhBNP提高動脈粥樣硬化大鼠血清中PGI2的含量，降低TXA2的含量，并且在形態上改善動脈粥樣硬化大鼠的血管內皮功能。

正常情況下，血管內皮細胞是一種具有選擇性的通透膜，具有促進分子之間的交換的功能，是血液與組織的一道天然屏障。它同時具有感受器及效應器功能，又是人體最大，功能活躍的內分泌，旁分泌及自分泌代謝器官，產生和分泌多種生物活性物質［1］，對血管的張力、生長、脂質代謝等方面起著調控作用。而PGI2／TXA2的平衡是維持內皮細胞完整的重要環節也是維持血小板正常形態和血液凝固的重要機制。在長期血脂紊亂情況下，增高的脂蛋白尤其是極低密度脂蛋白和膽固醇對動脈內膜產生功能性損傷，使單核細胞聚集、各種炎性因子分泌增多，進而促進結締組織增生、平滑肌細胞增殖。循環血液中的血小板就可粘附在損傷部位，致使TXA2合成增加，而PGI2合成減少，從而導致PGI2／TXA2平衡失調。正因為如此，如何應用藥物干預PGI2／TXA2的平衡將成為治療動脈粥樣硬化的新靶點。本研究分別應用硝酸酯、阿魏酸鈉及rhBNP觀察TXB2和6－Keto－PGF1a的變化旨在揭示不同藥物對PGI2／TXA2系統的影響，探討新活素改善內皮功能的機制。

rhBNP是利用基因工程技術合成的與BNP生物作用完全相同的重組產物，其在心力衰竭中的應用已得到廣泛認可。目前已有文獻表明了rhBNP在冠心病中的應用。已有研究表明張桂娟研究表明PGI2的含量與冠狀動脈病變支數成反比，動脈硬化越嚴重，PGI2合成越少，提示冠心病患者存在血管內皮細胞分泌血管活性物質的平衡失調［2］。魏慶民等關于rhBNP對豬急性心肌梗死患者PCI術后心室重塑和心室收縮同步性影響的研究證明rhBNP對急性心肌梗死的治療有效，無副作用［3］。美國加州大學舊金山醫學中心通過冠脈造影及冠脈內超聲（IVUS），觀察應用rhBNP治療ACS患者對冠狀動脈血管的影響，發現靜脈給藥30min，冠脈動脈血管明顯擴張，心肌耗氧量下降8%，提示rhBNP對ACS患者有治療益處［4］。王智慧等應用rhBNP治療44例急性冠脈綜合征患者臨床觀察中，在常規藥物治療的基礎上加用rhBNP后發現治療前后血清中NO及ET－1的含量差值較對照組患者血清中NO及ET－1的含量差值變化明顯［5］。

給予硝酸酯、阿魏酸鈉、rhBNP等藥物治療后，TXB2及6－Keto－PGF1a與處理前比較有差異（P＜0.05），二者趨于正常平衡。各處理組之間的比較無明顯差異，但新活素處理組不劣與硝酸酯、阿魏酸鈉組。本實驗發現重組人腦利鈉肽（新活素）對大鼠動脈粥樣硬化病變血液中PGI2、TXA2有影響，rhBNP改善血管內皮功能可能是通過維持PGI2－TXA2的穩定來發揮作用的。本實驗提示了rhBNP不僅作為治療急性失代償性心衰的藥物，在治療動脈粥樣硬化中也發揮重要作用。

［1］Anderson TJ.Asseement and treatment of endothelium dysfuction in humans［J］.Am coll cardiol，1999，34：631.

［2］張桂娟，趙 頌，張香梅 .冠心病患者血漿中內皮素和前列腺素變化的臨床意義及其與冠狀動脈病變支數的關系［J］.中國綜合臨床，2002，18（5）：419.

［3］魏慶民，等.靜脈應用重組人腦利鈉肽對急性心肌梗死經皮冠狀動脈介入治療后患者心室重塑和左心功能的影響［J］.中國全科醫學雜志，2007，10（8）：615.

［4］Andrew D.Effects of intravenous nesiritide on human coronary Vasomotor regulation and myocardial oxygen uptake［J］.Circulation，2003，107：2697.

［5］王智慧.重組人腦利鈉肽對急性冠脈綜合征患者內皮功能相關因子的影響［D］.長春：吉林大學第二醫院，2010.