中國吉林省地區朝鮮族及漢族正常人群內皮型一氧化氮合酶基因4a／bVNTR多態性分布的比較研究

李 淼，李 冰，吳 瓊，劉亞芳，丁奎成，全成實＊

（1.吉林大學第一醫院 病理診斷中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯誼醫院 心血管內科，吉林 長春130033；3.吉林大學病理生物學教育部重點實驗室，吉林 長春130021）

內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）為依賴鈣調蛋白的血管內皮固有酶。eNOS經多步氧化還原反應產生一氧化氮（nitric oxide，NO），從而刺激血管平滑肌產生cGMP，進而維持血管的基礎張力［1，2］。人類eNOS基因位于染色體7q35－36區，含26個外顯子和25個內含子［1］，1994年 Miyahara K 等 人［3］發現eNOS 基 因內含子4上的27bp數目可變的串聯重復序列（vari－able number of tandem repeats，VNTR），根據重復次數不同有兩種等位基因，重復4次為a等位基因，重復5次為b等位基因。4a／bVNTR多態性形成了3種基因型aa、ab和bb。對eN0S基因4a／bVNTR多態性大量研究發現，eNOS基因多態性與心腦血管等疾病關聯。目前，有關eNOS基因多態性的相關研究在中國漢族、蒙族和哈薩克族［4］中已有報道，但在中國朝鮮族人群eNOS基因4a／bVNTR多態性的研究尚未見報道。本研究應用PCR等技術，分析了我國吉林省地區朝鮮族和漢族正常人群eNOS基因4a／bVNTR多態性的分布情況，為不同民族eNOS基因4a／bVNTR多態性分布與慢性病相關性的前瞻性研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象 經過體格檢查及輔助檢查，選取各項指標均在正常范圍的吉林省地區正常人群共183人，其中朝鮮族92人（男性42人，女性50人），漢族91人（男性41人，女性50人）。年齡分布在40歲到76歲之間，平均年齡55歲。病史詢問主要排除高血壓病，糖尿病，心腦血管疾病，腫瘤等目前被證實與遺傳有關的疾病。受檢者采外周靜脈血2ml，4℃保存至提取基因組DNA。

1.2 方法 采用PCR等技術對中國吉林省地區朝鮮族正常人群92人和漢族人群91人的eNOS基因4a／b VNTR多態性進行了檢測，同時對其分布特征進行了分析。

1.2.1 基因組DNA提取 保存的含EDTA血樣用淋巴細胞提取液（鼎國公司）進行淋巴細胞分離，然后常規進行基因組DNA提取。

1.2.2 PCR擴增eNOS基因的特異片斷 參照文獻［5］設計引物，引物序列如下；forward：5′－AGG CCC TAT GGT AGT GCC TTT－3′，reverse：5′－TCT CTT AGT GCT GTG GTC AC－3′。引物由上海生工合成。用PCR試劑盒（TAKALA公司）進行PCR反應。PCR反應體系為20μl，其中含上下游引物各0.4μl，模板 DNA0.3μl，TagDNA 聚合酶混合物10μl，加去離子水9μl。在PCR擴增儀（PTC－100，MJ Reseach.公司）上進行如下循環：95℃熱啟動5min，95℃變性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個循環后72℃延伸7 min。取PCR擴增產物7μl，在4%的瓊脂糖凝膠中電泳1h，在紫外照射儀上觀察結果并攝影。

1.2.3 eNOS基因PCR擴增產物的分析及結果判定標準 eNOS基因型多態性表現為數目可變的串聯重復序列（VNTR），6次重復等位基因的PCR擴增片斷長447bp，包括162bp的重復序列（6＊27 bp）和285bp上下游側翼序列；5次和4次重復等位基因的PCR產物分別為420bp和393bp，其中重復序列分別為135bp（5個27bp的重復序列）和108bp（4個27bp的重復序列）［6］。eNOS基因第4內含子上有兩種等位基因，27bpVNTR重復4次為a等位基因，重復5次為b等位基因［7］。eNOS基因4a／bVNTR多態性形成了3種基因型aa，ab和bb。

1.2.4 統計學分析 以基因計數法計算正常人的基因型和等位基因頻率。用χ2檢驗及 Hardy－Weinberg平衡評估標本的群體代表性。并用χ2檢驗評估等位基因及基因型頻率的差異。應用SPSS1 2.0軟件包作統計學處理。

2 結果

2.1 Hardy－Weinberg遺傳平衡檢驗 經擬合優度χ2檢驗，eNOS4a／bVNTR基因的基因型頻率在朝鮮族和漢族人群中的分布符合Hardy－Weinberg遺傳平衡定律，P＞0.05，表明樣本具有群體代表性。

2.2 吉林省地區朝鮮族和漢族健康人群eNOS4a／bVNTR基因型檢測 eNOS基因的PCR產物為420bp和393bp，eNOS基因4a／bVNTR多態性形成了3種基因型aa，ab和bb，見圖1。92例朝鮮族正常人群中，aa型4名，ab型28名，bb型60名，3種基因型的頻率分別為0.043 48、0.304 3和0.652 2；在91例漢族正常人群中，aa型2名，ab型13名，bb型76名，3種基因型的頻率分別為0.021 98、0.142 9和0.835 2。吉林省地區朝鮮族eNOS基因aa＋ab基因型頻率顯著高于漢族（χ2＝8.026，P＜0.01），見表1。

2.3 吉林省地區朝鮮族和漢族健康人群eNOS基因等位基因檢測 吉林朝鮮族a和b兩種等位頻率分別為0.195 7和0.795 7；漢族a和b等位基因頻率分別為0.093 4和0.906 6，兩組差異均有統計學意義（χ2＝7.724，P＜0.01），見表1。

圖1 eNOS基因多態性位點電泳圖

表1 吉林朝族與漢族人群人eNOS基因4a／bVNTR多態性及等位基因分布

3 討論

eNOS是左旋精氨酸一氧化氮途徑的關鍵酶，其催化生成的NO具有舒張血管、調節血流、阻止腎素－血管緊張素的產生及抑制血小板聚集等作用［8］。目前認為，eNOS基因多態性與心腦血管等疾病關聯。有關朝鮮族和漢族正常人群的基因4a／bVNTR多態性的研究尚未見報道。人類基因多態性具有種族差異，這種差異可以造成不同人群對某些疾病的易感性不同。人類疾病幾乎都是遺傳因素與環境因素相互作用的結果，只是二者所占的比重在不同的疾病中有所不同。

關于吉林省地區朝鮮族和漢族健康調查研究發現，朝鮮族心腦血管病的死亡率明顯高于當地漢族［9］。這種差異可能與不良生活方式有關，但與遺傳因素的關系尚未見研究報道。本實驗結果顯示，92例朝鮮族正常人群中，aa型4名，ab型28名，bb型60名，3種基因型的頻率分別為0.043 48、0.304 3和0.652 2。91例漢族正常人群中，aa型2名，ab型13名，bb型76名，3種基因型的頻率分別為0.021 98，0.142 9 和 0.835 2。eNOS 基 因 4a／bVNTR多態性在吉林朝鮮族和漢族間存在種族差異，朝鮮族aa＋ab基因型頻率顯著高于漢族，同時發現a等位基因頻率明顯高于漢族。提示朝鮮族和漢族eNOS基因多態性分布可能與人群的生活習慣等密切相關。黃惠彬等人［10］研究發現，eNOS基因27bp VNTR多態性與中國漢族人高血壓的發生有關，攜帶重復a等位基因的人具有罹患高血壓的危險性。他們認為eNOS基因27bp VNTR多態性a等位基因攜帶者血管內皮的NO合成減少，損傷阻力血管內皮細胞功能，引起外周血管阻力增加從而引起舒張壓增高［11］。人們同時發現，NO的缺乏可以加速動脈粥樣硬化的發展，eNOS基因的改變可影響NOS蛋白的功能及活性，從而降低NO的合成，加速動脈粥樣硬化的發展［12］。Tsukada等［13］實，攜帶aa基因型者較bb基因型著血清NO水平降低23%，認為內含子4的多態性影響轉錄后mRNA的剪接過程，因而人群中不同的eNOS基因型有可能決定了不同個體間eNOS的表達與功能上的差異，進而影響到體內eNOS的生物學效應。鑒于中國人心血管病的發病率及死亡率均低于歐美國家，除環境、飲食等因素外，某些遺傳因素或許起著重要的作用。因此，獲得我國吉林省地區朝鮮族及漢族人群eNOS基因多態性位點的統計資料，對于進一步研究基因多態性與疾病的相關性將具有重要的應用價值。

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